构建诱导型CRISPR/Cas9系统用于小鼠免疫细胞基因功能研究

作者：赵艳娜; 邱荣; 沈南; 唐元家^*

来源：上海交通大学学报 (医学版), 2021, 41(03): 297-301.

DOI：10.3969/j.issn.1674-8115.2021.03.002

• 诱导型CRISPR/Cas9系统
• Dox诱导型sgRNA表达载体
• 造血干细胞
• 基因编辑
• 巨噬细胞

目的·结合Dox诱导型单链导向RNA (single guide RNA,sgRNA)表达载体和Cas9转基因小鼠,构建诱导型CRISPR/Cas9系统用于小鼠免疫细胞基因功能研究。方法·根据四环素诱导表达系统原理,基因合成U6-TetO-sgRNA和EF1α-T2A-Puro-BFP-T2ATetR片段。通过同源重组将2个片段组装进反转录病毒载体骨架,获得Dox诱导型sgRNA反转录病毒载体。为了验证系统有效性,分离Cas9转基因小鼠骨髓细胞并诱导其向巨噬细胞方向分化。设计对照(non-targeting control,NC)组和实验组(靶向F4/80)的sgRNA,利用反转录病毒感染细胞,分化条件设置添加Dox组(Dox+)和不添加Dox组(Dox-)。通过流式细胞术和T7核酸内切酶Ⅰ(T7 endonucleaseⅠ,T7EⅠ)实验检测基因敲除效果。结果·(1)成功构建Dox诱导型sgRNA反转录病毒表达载体和Cas9转基因小鼠。(2)流式结果显示,在NC Dox-组、NCDox+组和F4/80 Dox-组中,几乎无F4/80阴性细胞群体;而在F4/80 Dox+组中,F4/80阴性细胞群体高达50%。(3)T7EⅠ结果显示,在F4/80 Dox-组中,DNA条带完整,而在F4/80 Dox+组中发生基因突变,DNA条带被切开。结论·结合Dox诱导型sgRNA表达载体和Cas9转基因小鼠,成功构建诱导型CRISPR/Cas9系统。利用该系统成功在小鼠免疫细胞中实现可诱导性基因敲除。

• 单位
  上海交通大学医学院附属仁济医院; 中国科学院