线粒体自噬对脂多糖诱导髓核细胞NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3炎症小体活化的实验研究

作者：张曾; 赵家邦; 姜昊; 许少刚^*

来源：中华实验外科杂志, 2023, 40(06).

• 线粒体自噬
• 脂多糖
• 髓核细胞
• NLRP3

目的探讨线粒体自噬对脂多糖(LPS)诱导的髓核(NP)细胞NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)炎症小体活化的影响。方法以大鼠椎间盘NP细胞为研究对象, 首先以LPS(200 μg/ml)分别干预髓核细胞0、24、48 h, 通过蛋白质印迹法(Western blot)检测LPS对NLRP3炎症小体活化和线粒体自噬的影响;通过免疫荧光观察LPS对线粒体自噬水平的影响;组间比较采用单因素方差分析。进一步利用线粒体自噬抑制剂Mdivi-1阻断线粒体自噬, 实验分组为对照组(con)、LPS(24 h)+Mdivi-1、LPS(24 h)。通过Western blot检测Mdivi-1对LPS诱导的NLRP3炎症小体活化的影响;通过免疫荧光评估各实验组Mito Tracker Red探针标记的线粒体与LC3B及NLRP3的细胞内共定位;通过免疫荧光评估各实验组Mito Tracker Red探针标记的线粒体与LC3B的细胞内共定位;通过免疫荧光检测分析Mdivi-1对LPS诱导的NP细胞线粒体膜电位(ΔΨm)及线粒体ROS的影响;组间比较采用t检验。结果与对照组比较, 随着LPS干预时间延长(24、48 h), NLRP3(F=175.147, P<0.01)、GSDMD (F=398.479, P<0.01)、裂解的GSDMD(cleaved-GSDMD, F=327.951, P<0.01)和白细胞介素(IL)-1β (F=228.902, P<0.01)的蛋白表达逐渐上调;与对照组比较, 在LPS(24 h)组p62蛋白表达明显降低(t=14.336, P<0.01)而LC3B Ⅱ蛋白表达明显升高(t=10.909, P<0.01);对比分析LPS(24 h)组和LPS(48 h)组发现, LPS(48 h)组p62蛋白表达明显升高(t=-13.972, P<0.01)而LC3B Ⅱ蛋白表达明显降低(t=6.247, P<0.05);免疫荧光观察线粒体和LC3B共定位显示, 与对照组比较, 在LPS干预24 h后线粒体自噬增强(t=-11.408, P<0.01), 而在LPS干预48 h后线粒体自噬逐渐减弱(t=9.869, P<0.05);利用Mdivi-1阻断线粒体自噬后显示, 与LPS(24 h)组比较, 在Mdivi-1预处理组NLRP3 (t=-7.551, P<0.05)、GSDMD(t=-7.089, P<0.05)、cleaved-GSDMD(t=-4.396, P<0.05)和IL-1β (t=-10.451, P<0.01)的表达明显升高, ΔΨm丢失更加严重(t=-6.213, P<0.05), 线粒体ROS产生增加(t=-6.496, P<0.05)。结论阻断线粒体自噬进一步活化了LPS诱导的NLRP3炎症小体, 表明线粒体自噬在LPS诱导NP细胞死亡中具有保护作用。

• 单位
  郑州市骨科医院