猪流行性腹泻病毒经典毒株与变异毒株双重荧光定量PCR检测方法的建立及应用

作者：苏金辉; 邓云贵; 夏冰

来源：中国动物传染病学报, 2022, 1-9.

DOI：10.19958/j.cnki.cn31-2031/s.20221014.001

• 猪流行性腹泻病毒
• 变异毒株
• 实时荧光定量PCR

建立一种可以快速鉴别诊断猪流行性腹泻病毒（PEDV）经典毒株和变异毒株的TaqMan双重实时荧光定量PCR。参照GenBank中收录的36株经典毒株和变异毒株的基因序列，设计特异性引物和探针优化反应条件。进行双重实时荧光定量PCR的特异性试验、灵敏性试验和重复性试验，并绘制标准曲线。本研究建立的方法和国家标准方法同时对临床收集的样品进行检测。通过条件优化，该方法的最佳退火温度是60℃，最佳引物浓度为0.5 μmol/L，最佳探针浓度为0.5 μmol/L。本方法对猪场常见疫病病毒PRRSV、ASFV、CSFV、PCV2、PCV3、PRV、PPV、TGEV均无交叉反应，特异性强。对N基因和S基因的检测下限分别为1 copies/μL和10 copies/μL。以N基因和S基因重组质粒构建的标准曲线具有良好的线性关系，线性相关系数(R2)均为0.999。组内和组间变异系数均小于2%，具有良好的重复性。临床样品检测结果为阳性率17.09%，与国标推荐的检测方法阳性率一致；变异毒株阳性率80%，经典毒株阳性率20%，与扩增S基因测序比对后结果一致。本研究建立一种具有特异性强、灵敏度高、重复性好等优点的双重实时荧光定量PCR方法，对PED风险预警及毒株分型具有重要意义。

• 单位
  中国中医科学院中药研究所; 北京大北农科技集团股份有限公司