利用CRISPR/Cas9技术敲除TLR3基因及其影响NDV复制的研究

作者：邵玉乐; 许曼; 王辉; 曾为俊; 鲁国涛; 赵丽丽; 陈洪岩; 刘建华^*; 孟庆文^*

来源：中国兽医科学, 2019, 49(09): 1128-1135.

DOI：10.16656/j.issn.1673-4696.2019.0152

• TLR3
• MDCK
• CRISPR/Cas9
• 新城疫病毒

TLR3是Toll样受体家族成员之一,在天然免疫与适应性免疫应答中均发挥重要作用。为探究TLR3在NDV感染中的作用机制,本研究针对犬TLR3基因设计了2个sgRNA,构建重组质粒,转染MDCK细胞,经PCR、测序、Western-blot检测敲除情况,CCK-8方法检测细胞增殖速度;新城疫病毒La Sota毒株感染细胞,荧光定量PCR分析病毒增殖水平和TLR3、TLR7、MDA5、IFN-β和IFIT1的m RNA水平。结果,筛选出1株TLR3基因缺失7 bp的MDCK细胞。Western-blot结果显示,TLR3蛋白不表达,其增殖速度与野生型MDCK细胞无显著差异。新城疫病毒La Sota毒株感染MDCK-WT细胞后,TLR3的m RNA含量在四个时间点均显著上调(P<0.01),表明新城疫病毒La Sota毒株可激活TLR3。再以新城疫病毒La Sota毒株感染MDCK-TLR3-/-细胞,IFN-β和IFIT1的m RNA含量在感染后第12小时和第24小时显著降低(P<0.01),病毒拷贝数在感染后第6、12和24小时显著高于WT组(P<0.01),表明TLR3在NDV介导的IFN-β反应和IFIT1的表达中具有重要作用,能够抑制NDV的复制。TLR7和MDA5的m RNA含量在感染后第6小时和第12小时显著上调(P<0.01),IFN-β和IFIT1的m RNA含量在感染后第48小时表达显著上调(P<0.01),NDV的拷贝数在第48小时在两组间显著性差异消失,提示TLR3缺失后TLR7和MDA5对其具有代偿作用。上述研究结果对NDV介导的天然免疫应答及疾病防控等研究具有重要意义。

• 单位
  兽医生物技术国家重点实验室; 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所; 新疆农业大学