Mpl基因RNA干扰载体的构建及荧光显微镜筛选

作者：邹宇光; 莫玉叶; 庞实锋; 张强; 杨芳; 易文君; 何**; 喻巍巍; 郑克勤

来源：贵阳医学院学报, 2012, 37(06): 587-592.

DOI：10.19367/j.cnki.1000-2707.2012.06.003

• 绿色荧光蛋白
• RNA干扰
• 基因融合

目的:建立荧光显微镜快速筛选对血小板生成素受体(Mpl)基因RNA干扰片段的方法。方法:通过体外重组技术将Mpl与绿色荧光蛋白(GFP)构建成融合基因,克隆进pDs载体中产生pDs-Mpl-GFP载体,将人U6启动子及5个Mpl shRNA发夹结构(shMpl-A,shMpl-B,shMpl-C,shMpl-D,shMpl-E)分别克隆至pDs-Mpl-GFP真核载体中,构建出针对Mpl 5个不同位点的RNA干扰载体,然后将获得的上述干扰载体通过脂质体方法转染至293T细胞中,用荧光显微镜观察293T细胞的荧光发光强度及荧光细胞数,判定构建的RNA干扰载体对靶基因RNA的干扰效果。结果:构建的5个干扰载体都能对转染的293T细胞中的Mpl-GFP融合基因进行有效的基因敲减作用,在pDs-Mpl-GFP-TK-U6-shMpl-A、pDs-Mpl-GFP-TK-U6-shMpl-B与pDs-Mpl-GFP-TK-U6-shMpl-E的干扰作用下,293T细胞中的荧光强度及发荧光细胞数目变得更少和更弱,干扰效果较好,而其它两个效果较差;在这三个较好的干扰载体中,pDs-Mpl-GFP-TK-U6-shMpl-A的干扰效果最好。结论:成功构建Mpl基因的真核RNA干扰载体,并筛选出有效的RNA干扰片段。

• 单位
  深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司; 广东医科大学