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摘要
肝核因子3β (hepatocyte nuclear factor 3β, HNF 3β)作为一个重要的转录调控因子，参与哺乳动物的前肠胚和肝脏发育以及成体肝内的能量代谢，而HNF 3β在鸡(Gallus gallus)中的功能还不清楚。为研究鸡HNF 3β在肝内糖脂代谢中的作用提供有效的抗体，本研究优化合成了鸡Hnf 3β基因编码区片段，以pET 30a表达载体在大肠杆菌(Escherichia coli)中进行重组蛋白HNF 3β的表达，用6 mol/L尿素变性包涵体，Ni2+对重组蛋白进行亲和层析，并以快速稀释法复性重组蛋白，以离心超滤法收集、浓缩目的蛋白；取纯化的HNF 3β重组蛋白和弗氏佐剂乳化后免疫兔(Oryctolagus cuniculus)，制备鸡HNF 3β的抗血清，以酶联免疫吸附测定法(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)测定抗血清效价后，用Protein A法纯化抗体；通过检测鸡肝癌细胞系(leghorn male hepatoma, LMH)中HNF 3β蛋白的表达情况验证所制备抗体的效果。结果表明，优化合成的Hnf 3β基因片段在大肠杆菌中实现了重组蛋白的高效表达；在6 mol/L尿素的变性条件下，Ni2+亲和层析一步法获得纯度大于95%的重组蛋白，结合快速稀释法获得了可溶性的重组蛋白HNF 3β；经重组蛋白4次免疫后，抗血清效价超过1∶64 000；免疫印迹结果显示，制备的抗体能特异性的检测出LMH细胞中HNF 3β蛋白的表达。综上所述，本研究利用制备的高纯度重组蛋白HNF3β免疫兔获得了高特异性和高效价的多克隆抗体，可以为检测鸡HNF 3β蛋白分子及研究其功能提供可靠的抗体。
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