嗜热菌ToPif1解旋酶与G四链体的互作活性位点预测及鉴定

作者：张玲玲; 戴阳雪; 奚绪光^*

来源：陕西师范大学学报(自然科学版), 2022, 50(05): 99-107.

DOI：10.15983/j.cnki.jsnu.2022023

• 解旋酶
• 活性位点
• AlphaFold2结构预测
• G四链体
• Pif1家族

利用AlphaFold2人工智能程序在原子水平预测并验证嗜热菌Themus oshimai Pif1(ToPif1)解旋酶参与特殊核酸二级结构G四链体(G4)解旋的关键活性位点。采用变温圆二色光谱测试及解旋实验确定ToPif1解旋酶的嗜热特性；利用AlphaFold2程序预测ToPif1与G4 DNA的互作氨基酸位点，并应用分子生物学工具将预测互作位点分别突变为丙氨酸；通过原核表达系统获得ToPif1的单点突变体蛋白，突变体蛋白经ATP水解实验验证后发现其基本活性不受损；通过荧光各向异性实验和荧光共振能量转移偶联快速停留技术对比ToPif1野生型和突变体对不同构型G4 DNA的结合活性及解旋活性差异，确认影响ToPif1结合和解旋G4的关键氨基酸位点。结果表明：ToPif1解旋酶在高温下仍可保持蛋白构象及解旋活力；预测结果显示ToPif1上存在8个与G4互作的潜在位点，且这些位点的单点突变均不会破坏ToPif1的ATP水解活力；在ToPif1结合G4CEB和G4Tel中发挥关键作用的氨基酸位点是R355,而显著影响ToPif1解旋G4活力的位点是R135和R355。研究结果明确了具有嗜热特性的ToPif1发挥结合、解旋G4 DNA活性的关键氨基酸位点，为理解嗜热菌Pif1解旋酶识别与解旋G4 DNA的机理提供了参考。

• 单位
  生命科学学院; 西北农林科技大学