共表达MEL和Ec-cLYZ重组表达质粒的构建及其重组蛋白的抑菌效果评价

作者：陈婷; 何敬文; 赵微; 扈立伟; 任君; **; 顾天越; 包利霞; 金天明^*

来源：黑龙江畜牧兽医, 2023, (09): 1-127.

DOI：10.13881/j.cnki.hljxmsy.2022.05.0126

• 蜂毒肽
• c型溶菌酶
• 抑菌
• 毕赤酵母
• 共表达

为了表达一种高效低毒的广谱抑菌蛋白，试验通过T2A连接肽连接蜂毒肽(MEL)与斜带石斑鱼c型溶菌酶(Ec-cLYZ)基因，并克隆至pPICZαA质粒上构建重组表达质粒；将鉴定正确的重组表达质粒用限制性内切酶SacⅠ线性化后电转化至毕赤酵母表达菌株GS115感受态细胞中，构建毕赤酵母表达菌株；利用0.5%甲醇诱导表达，收集上清液进行冻干浓缩并纯化，采用Western-blot法检测重组蛋白的表达情况，BCA蛋白浓度测定试剂盒测定重组蛋白浓度，试管二倍稀释法分别检测不同浓度重组蛋白对兔红细胞的溶血活性，牛津杯法评价重组蛋白的抑菌效果。结果表明：成功构建出重组表达质粒pPICZαA-Ec-cLYZ-MEL、pPICZαA-Ec-cLYZ和pPICZαA-MEL及毕赤酵母表达菌株GS115/pPICZαA-Ec-cLYZ-MEL、GS115/pPICZαA-Ec-cLYZ和GS115/pPICZαA-MEL;经甲醇诱导，GS115/pPICZαA-Ec-cLYZ-MEL表达出分子质量为16.5,3.4 ku的重组蛋白，GS115/pPICZαA-Ec-cLYZ表达出分子质量为16.5 ku的重组蛋白，GS115/pPICZαA-MEL表达出分子质量为3.4 ku的重组蛋白；上清液中重组蛋白Ec-cLYZ-MEL、Ec-cLYZ、MEL的浓度分别为35.49,28.73,27.31 mg/L;重组蛋白Ec-cLYZ-MEL、Ec-cLYZ、MEL在浓度为150 mg/L时对兔红细胞的溶血率分别为2.3%、2.9%、79.0%;停乳链球菌对重组蛋白Ec-cLYZ-MEL高度敏感，表皮葡萄球菌对重组蛋白Ec-cLYZ-MEL中度敏感，金黄色葡萄球菌和大肠杆菌对重组蛋白Ec-cLYZ-MEL低度敏感，且重组蛋白Ec-cLYZ-MEL对测试菌株的抑菌效果优于重组蛋白Ec-cLYZ和MEL。说明重组蛋白Ec-cLYZ-MEL对红细胞无溶血活性且具有良好的抑菌活性。

• 单位
  天津市农业科学院; 天津农学院