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摘要
目的探究N6-甲基腺苷(N6-methyladenosine, m6A)修饰调控RP11-426A6.5在喉鳞状细胞癌(laryngeal squamous cell carcinoma, LSCC)发生与发展过程中的作用机制。方法收集2017年1月至9月哈尔滨医科大学附属第二医院耳鼻咽喉头颈外科收治的48例LSCC患者的癌及癌旁组织, 选取其中3例LSCC样本利用长链非编码RNA(long non-coding RNA, lncRNA)m6A甲基化芯片及表达谱芯片技术检测lncRNAs的甲基化和表达水平并筛选关键lncRNA。通过甲基化RNA免疫共沉淀-定量PCR(methylated RNA immunoprecipitation-quantitative PCR, MeRIP-qPCR)及实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR, qRT-PCR)在其余45例LSCC样本中验证RP11-426A6.5的m6A修饰和表达水平, 并分析RP11-426A6.5与肿瘤恶性程度、预后等临床因素间的相关性。在体外, 运用RNA干扰(RNA interference, RNAi)技术构建低表达RP11-426A6.5喉癌细胞系, 以EdU细胞增殖检测实验、伤口愈合实验、Transwell侵袭实验分别观察LSCC细胞的增殖、迁移、侵袭等生物学功能变化, 以裸鼠成瘤实验验证RP11-426A6.5下调后对体内移植瘤生长的影响。应用TCGA数据库及SRAMP网站预测介导RP11-426A6.5 m6A修饰的相关酶及相应甲基化位点, 选用MazF酶切法对结合位点验证。运用RNAi技术在细胞水平干扰修饰酶相应基因表达后观察细胞功能的改变并利用MeRIP-qPCR检测RP11-426A6.5 m6A水平变化, 以放射线菌素D处理细胞系观察RP11-426A6.5稳定性改变。结果 LSCC组织中RP11-426A6.5甲基化及表达水平明显高于癌旁组织[RP11-426A6.5甲基化水平:癌组织(23.828±4.975)比癌旁组织(20.280±3.607), RP11-426A6.5表达水平:癌组织(1.197±0.314)比癌旁组织(1.015±0.170), P值均<0.05], 且RP11-426A6.5表达水平与肿瘤大小(T期)密切相关[T1-2期(1.081±0.298)比T3-4期(1.306±0.292), χ2=5.35, P<0.05]。RP11-426A6.5高表达患者的术后生存期明显低于低表达组患者, 差异有统计学意义(P=0.046)。体内外试验结果显示下调RP11-426A6.5后LSCC细胞增殖、迁移、侵袭能力显著下降且移植瘤生长受到明显抑制。m6A修饰酶中甲基化转移酶样蛋白3(methyltransferase-like 3, METTL3)与RP11-426A6.5相应甲基化位点结合增强其稳定性并介导其对LSCC细胞恶性行为的调控。结论 RP11-426A6.5能够调控LSCC细胞的恶性行为并受到甲基转移酶METTL3所参与的m6A修饰过程调控。
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