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摘要
本研究利用RT-PCR检测LncRNA-NEAT1基因表达在细胞中的亚定位，采用5′RACE获得LncRNA-NEAT1基因的转录起始位点；利用CRISPOR软件对-300～0 bp区域的LncRNA-NEAT1启动子序列设计sgRNA并构建到px330载体，通过转染细胞与T7E1酶切验证sgRNA效率；利用酶切和亚克隆方法将dCas9-KRAB-BSD片段替换px330载体的Cas9序列，形成重组px330-dCas9-KRAB载体；将验证有效的sgRNA构建到px330-dCas9-KRAB载体，形成px330-sgRNA-dCas9-KRAB载体。添加不同质量浓度的Blasticidin S处理细胞，以最小致死质量浓度来确定筛选质量浓度。转染px330-sgRNA-dCas9-KRAB载体并用Blasticidin S筛选细胞7 d后进行LncRNA-NEAT1基因的表达检测，同时对sgRNA在LncRNA-NEAT1基因启动子上的结合位点进行Sanger测序，以进一步验证上述结合位点是否发生切割。结果显示LncRNA-NEAT1主要表达于细胞核，而在细胞质中几乎不表达。5′RACE获得了LncRNA-NEAT1 5′端大约270 bp的序列。qPCR检测结果显示，与对照组相比，sgRNA1和sgRNA2能够显著抑制LncRNA-NEAT1的表达(P<0.05)。Sanger测序结果表明sgRNA1和sgRNA2所在的位点并没有发生碱基缺失和插入。研究结果为后续进一步研究LncRNA-NEAT1在先天性免疫反应中的功能奠定了基础。
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