昆虫双杂交实验中家蚕BmHSP83和BmMAD3蛋白引起的假性现象

作者：方康; 彭海涛; 胡琼波^*

来源：环境昆虫学报, 2022, 44(01): 170-176.

• 昆虫双杂交
• 假性
• 家蚕
• HSP83
• MAD3

昆虫双杂交(Insect two-hybrid, I2H)技术是研究昆虫细胞蛋白质相互作用的一种方法。本研究利用Gateway克隆技术，构建了家蚕Bombyx mori蛋白BmHSP83和BmPDIA5,以及BmMAD3和BmMAN1的I2H载体；然后，将载体与报告质粒pUAS-Luc一起转染SF-9细胞，检测其发光值。结果表明，转染pIE2-AD-BmHSP83或pIE2-AD-BmMAD3载体与转染pUAS-Luc的对照组的细胞发光值无明显差异，报告基因未被激活；分别单独用pIE2-DBD-BmHSP83或pIE2-DBD-BmMAD3质粒转染细胞时，发光强度显著增加，报告基因被激活，说明BmHSP83和BmMAD3造成了假阳性结果；并且当细胞共转染pIE2-DBD-BmHSP83和pIE2-AD-BmPDIA5、pIE2-DBD-BmMAD3和pIE2-AD-BmMAN1时报告基因的激活反应显著提高，提示BmHSP83与BmPDIA5、BmMAD3与BmMAN1存在互作关系从而引起阳性反应，且与BmHSP83和BmMAD3的假阳性形成叠加效应；然而，当共转染pIE2-AD-BmHSP83和pIE2-DBD-BmPDIA5、pIE2-AD-BmMAD3和pIE2-DBD-BmMAN1时报告基因未被激活，显示pIE2-AD-BmHSP83/BmMAD3导致了假阴性。BmHSP83和BmMAD3引起I2H假性现象可能与该二种蛋白具有转录激活功能有关，当其与DNA结合结构域(DNA binding domain, DBD)融合表达时，该融合体即具备了DNA结合及转录激活两个功能，因而可以启动下游报告基因的表达；反之，当其与转录激活结构域(AD)融合表达时，则阻止了他们各自与BmPDIA5、BmMAN1蛋白的互作。本研究结果为那些利用I2H体系研究具有转录激活功能的蛋白质相互作用提供借鉴。

• 单位
  华南农业大学