miR-9和miR-124共表达载体的构建与靶分子鉴定

作者：薛茜; 王琰; 张坤; 赵湘辉; 田婉莹; 杨安钢; 鞠躬; 王键

来源：细胞与分子免疫学杂志, 2015, 31(06): 800-804.

DOI：10.13423/j.cnki.cjcmi.007426

• miRNA
• 共表达载体
• 脊髓损伤

目的构建miR-9和miR-124单独表达和串联共表达的真核表达载体,并鉴定其共同靶分子。方法将pri-miR-9和pri-miR-124的编码序列分别插入或串联后插入真核表达载体p CAG,转染He La细胞后,实时定量PCR鉴定成熟miRNA的表达水平。构建miR-9和miR-124分子完全互补的靶基因萤光素酶报告载体,双萤光素酶报告系统检测表达的成熟miRNA的生物学功能。利用生物信息学软件预测miR-9和miR-124的共同靶分子,将靶分子mRNA的3’非翻译区(UTR)克隆入p GL3luciferase报告基因载体中,观察转染细胞后miRNA对报告基因表达的影响。结果经测序及酶切鉴定证实3种miRNA表达载体构建完全正确,实时定量PCR检测表明这3种表达载体均能正确高表达成熟的miRNA。双萤光素酶报告系统检测证实3种载体表达的miRNA分子具有生物学活性。生物学软件预测发现小分子GTP结合蛋白Ras相关蛋白2a(Rap2a)是miR-9和miR-124的靶基因,成功构建了含有Rap2a 3’UTR的萤光素酶报告基因载体。双萤光素酶报告系统提示miR-9和miR-124均能抑制Rap2a的表达。结论成功构建了miR-9和miR-124的单独表达和共表达载体,并能高表达具有生物学活性的成熟的miR-9和miR-124分子。Rap2a可能是miR-9和miR-124的一个共同靶分子。

• 单位
  陕西省人民医院; 第四军医大学; 西安交通大学口腔医院