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摘要
目的：基于核酸试纸条技术，建立一种快速检测蜡样芽胞杆菌entFM毒素基因的方法。方方法法：煮沸法提取蜡样芽胞杆菌DNA，以蜡样芽胞杆菌entFM毒素基因作为靶基因，采用NCBI primer-BLAST 5.0软件设计特异性引物并通过克隆转化鉴定PCR产物，建立并组装核酸试纸条，评价核酸试纸条的特异性、灵敏度和稳定性。结果：蜡样芽胞杆菌DNA浓度为300 mg·L-1，纯度约为1.60。PCR产物阳性条带经切胶回收、克隆转化和测序比对，与GenBank数据库中已登记的entFM相似性为100%。在pH值7.0条件下，每100μL胶体金溶液加入3.3μg链霉亲和素浓度标记，质控线浓度为1.8 g·L-1，检测线浓度为1 g·L-1时，硝酸纤维素膜上质控线与检测线均可与PCR产物反应出现清晰的红色条带。按照最适条件组装成核酸试纸条，PCR产物6μL，样品展开液100μL，检测10 min后可观察结果。核酸试纸条特异性与电泳结果一致，仅蜡样芽胞杆菌为阳性结果，与金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞杆菌、大肠埃希菌和沙门氏菌皆无交叉反应，为阴性结果；灵敏度检测，核酸试纸条DNA质量浓度同时降至10-3mg·L-1仍可准确检测，普通PCR电泳结果显示DNA质量浓度同时降至10-1mg·L-1出现目的条带，核酸试纸条比普通PCR灵敏度提高100倍；稳定性检测，核酸试纸条在第6、9和12个月进行检测稳定性一致。结论：建立的核酸试纸条检测蜡样芽胞杆菌entFM毒素基因灵敏度高、特异性强且具有良好稳定性，适用于快速鉴别蜡样芽胞杆菌entFM毒素基因。
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单位山东省聊城市人民医院; 北华大学
