宫颈癌细胞PAX1基因甲基化的CRISPR靶向调控系统的构建

作者：张文帆; 杨金豪; 陈爽; 时淑娟; 王蓉^*

来源：天津医科大学学报, 2022, 28(05): 491-496.

• 宫颈癌
• PAX1
• DNA甲基化
• CRISPR调控

目的：建立PAX1基因甲基化的CRISPR靶向调控系统。方法：首先，通过甲基化特异性PCR(MSP)测定宫颈癌细胞系（CaSki,SiHa）及正常细胞（人胚肾细胞HEK293T）中PAX1基因启动子的DNA甲基化水平；通过荧光定量PCR(RT-PCR)和免疫印迹（Western blotting）分别检测上述细胞系的mRNA及蛋白表达。然后，在PAX1高甲基化的宫颈癌细胞共转染sgRNA(single guide RNA)和dCas9-Tet1质粒，采用焦磷酸测序（Pyrosequencing）和RT-PCR分别检测其基因甲基化和表达水平的改变。最后，结合生物信息学预测和RT-PCR评估该CRISPR系统的脱靶效应。结果：与HEK293T细胞相比，宫颈癌细胞的PAX1基因启动子呈现高甲基化，且其mRNA(Ca Ski:t=9.13;SiHa:t=12.31;P<0.05)和蛋白表达水平（CaSki:t=16.72;SiHa:t=11.81;P<0.05）均降低。在Ca Ski及SiHa细胞系中，去甲基化sgRNA3(act-sgRNA3)组调控最显著，其PAX1基因的甲基化水平在CaSki和SiHa细胞系中分别下降了22.21%(t=6.65,P<0.05)、19.62%(t=17.00,P<0.05)，其mRNA表达水平均显著上调（P<0.05）。且该系统脱靶效应基因的表达差异均小于2倍。结论：本研究成功建立了PAX1基因甲基化的CRISPR靶向调控系统，可有效的降低其甲基化水平，增强其内源性的表达水平。

• 单位
  天津医科大学; 基础医学院