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摘要
目的 探讨转化生长因子-β3(transforming growth factor-β3, TGF-β3)体外诱导人牙髓干细胞(human dental pulp stem cells, hDPSCs)成骨向分化的效果及可能机制。方法 采用免疫荧光技术观察原代hDPSCs基质细胞抗原STRO-1的免疫荧光染色情况，应用流式细胞仪检测原代hDPSCs细胞CD90、CD73、CD105表达情况，鉴别是否为hDPSCs。应用倒置显微镜观察培养第1～7天hDPSCs形态变化。原代hDPSCs传代培养至第3代对数生长期，随机分为空白组、实验组、对照组，空白组继续在常规培养基中培养，实验组在常规培养基中加入80μg/L TGF-β3后培养，对照组在常规培养基中加入10 mmol/Lβ-甘油磷酸盐、100 nmol/L地塞米松、50 mg/L抗坏血酸后培养。培养第7天，采用实时荧光定量PCR法检测3组细胞TGF-βⅠ型受体(TGF-βreceptor typeⅠ, TGF-βRⅠ)、Smad2、Smad3、Smad4 mRNA相对表达量，采用Western blot法检测3组细胞骨钙素(osteocalcin, OCN)、Runx-2、TGF-βRⅠ、Smad2/Smad3、p-Smad2、p-Smad3、Smad4蛋白相对表达量；培养第14、21天，采用茜素红染色观察3组钙化结节情况。结果 原代hDPSCs基质细胞抗原STRO-1免疫荧光染色呈阳性，hDPSCs细胞表面CD90、CD73、CD105阳性表达率分别为93.4%、98.2%、89.1%;鉴定原代细胞为hDPSCs。第3代hDPSCs培养第1～3天，细胞多呈不规则多角形、梭形或三角形；培养第4～7天，细胞逐渐呈长条状梭形。培养第7天，实验组细胞TGF-βRⅠ、Smad2、Smad3、Smad4 mRNA相对表达量(1.69±0.25、1.84±0.15、1.73±0.29、1.79±0.25)均高于空白组(1.02±0.30、1.02±0.30、1.00±0.25、1.01±0.26)(P<0.05),Smad2、Smad4 mRNA相对表达量均高于对照组(1.41±0.11、1.33±0.12)(P<0.05),TGF-βRⅠ、Smad3 mRNA相对表达量与对照组(1.50±0.12、1.43±0.24)比较差异均无统计学意义(P>0.05);对照组细胞TGF-βRⅠmRNA相对表达量高于空白组(P<0.05),Smad2、Smad3、Smad4 mRNA相对表达量与空白组比较差异均无统计学意义(P>0.05)。实验组细胞Runx-2、OCN、TGF-βRⅠ、Smad2/Smad3、p-Smad2、p-Smad3、Smad4蛋白相对表达量均高于空白组(P<0.05),Runx-2、OCN、Smad4蛋白相对表达量均高于对照组(P<0.05),TGF-βRⅠ、Smad2/Smad3、p-Smad2、p-Smad3与对照组比较差异均无统计学意义(P>0.05);对照组细胞Runx-2、TGF-βRⅠ、Smad2/Smad3、p-Smad2、p-Smad3、Smad4蛋白相对表达量均高于空白组(P<0.05),OCN蛋白相对表达量与空白组比较差异无统计学意义(P>0.05)。培养第14天，实验组、对照组出现多个大小不等的红色沉积物；培养第21天，实验组、对照组红色沉积物增多，成骨向分化程度增高，实验组矿化结节数量多于空白组、对照组。结论 TGF-β3可在体外有效促进hDPSCs的成骨向分化，其机制可能是通过提高SMAD2、SMAD4基因表达促进成骨蛋白OCN、Runx-2表达。
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单位徐州市口腔医院; 新疆维吾尔自治区人民医院; 重庆大学
