一株产高酶活性碱性磷酸酶解淀粉芽孢杆菌的分离及其phoD碱性磷酸酶基因的克隆与表达

作者：熊梦霞; 廖华媛; 郑金; 何景锋; 曹锟; 余兴龙^*

来源：微生物学通报, 2022, 49(02): 505-513.

DOI：10.13344/j.microbiol.china.210506

• 碱性磷酸酶
• 筛选
• 解淀粉芽孢杆菌
• phoD
• 酶学性质

[背景]碱性磷酸酶作为工具酶被广泛应用于各个领域,在免疫学检测方面应用较多的是PhoA家族的碱性磷酸酶,尚无关于PhoD家族的碱性磷酸酶在免疫学检测方面的研究。[目的]筛选出一株产高酶活性PhoD家族碱性磷酸酶的细菌,并将其phoD基因进行克隆表达,研究PhoD的酶学性质,为PhoD家族的碱性磷酸酶在免疫学检测方面的应用奠定一定的基础。[方法]采取有机质丰富的土样在有机磷平板中进行细菌分离,以4-硝基苯磷酸二钠盐(4-nitrophenyl phosphate disodium salt hexahydrate,p-NPP)为底物测定有机磷平板中单菌落的酶活性,选取酶活性高的菌株作为目的菌株,克隆其phoD基因。[结果]筛选到一株产碱性磷酸酶酶活性高的菌株S2-4,通过16S rRNA基因序列同源性比较分析,鉴定该菌株为解淀粉芽孢杆菌,克隆了其phoD基因并进行诱导表达。研究了纯化后PhoD的酶学性质,PhoD的最适反应温度为70℃;最适反应pH为9.8;PhoD最适Ca2+浓度为3 mmol/L,Mg2+对PhoD的酶活性有抑制作用,K+、Zn2+、Mn2+和Fe2+对PhoD的酶活性没有明显影响;以p-NPP为底物,在25℃下测得PhoD的Km为5.94 mmol/L,Vmax为31.46μmol/(L·min),kcat值为103.59 s-1,为大肠杆菌碱性磷酸酶EAPKcat值的1.60倍。[结论]菌株S2-4能产高酶活性的碱性磷酸酶,其含有的PhoD为单体酶,催化效率高于EAP,是比EAP具有更大优势的标记酶。

• 单位
  湖南农业大学; 湖南康保特生物科技有限公司