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摘要
本研究旨在培养梅花鹿耳成纤维细胞，优化脂质体转染梅花鹿耳成纤维细胞的条件，以获得最优质粒转染参数，为开展目标蛋白质在梅花鹿耳成纤维细胞的功能研究提供理论和技术依据。采用组织块贴壁法和差速贴壁法分离梅花鹿耳成纤维细胞，观察细胞基本形态特征变化，免疫荧光法鉴定波形蛋白（Vimentin）的表达；以增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因为标记基因，利用Lipofectamine~(TM)3000介导外源DNA转染梅花鹿耳成纤维细胞，探讨质粒DNA与脂质体比例（1：1.0、1：1.5、1：2.0、1：2.5、1：3.0）、质粒用量（0.5 μg、1.0 μg、1.5 μg、2.0 μg、2.5 μg）、细胞传代次数（第2～6代）、细胞初始接种密度（50%、60%、70%、80%、90%）、转染效果观测时间（12、24、36、48、60 h）对转染效率的影响。结果显示，组织块贴壁法培养的梅花鹿耳成纤维细胞在倒置荧光显微镜下可见长梭形细胞生长，细胞免疫荧光检测波形蛋白（Vimentin）的表达结果为阳性；筛选的最佳转染条件：当质粒DNA与脂质体比例为1：2.0，质粒DNA用量为1.5 μg，细胞传代次数为第三代，细胞初始接种密度为70%，转染后48 h进行观测时，即可获得较佳的转染效率。本研究成功分离培养梅花鹿耳成纤维细胞，筛选出了脂质体转染梅花鹿耳成纤维细胞的最佳条件，可为梅花鹿基因工程的相关研究提供重要参考依据。
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单位中国农业科学院特产研究所
