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摘要
目的 建立过表达人干细胞因子(stem cell factor, SCF)受体c-kit基因突变小鼠红白血病HCD57细胞株，以应用于抗癌小分子药物筛选。方法 以带有人c-kit-D816V基因突变质粒为模板，设计并合成引物，PCR扩增c-kit基因，逆转录病毒载体用限制性内切酶EcoRⅠ进行单酶切，采用同源重组法构建pMSCV-c-kit-D816V表达载体。采用酶切和基因测序对重组质粒进行鉴定。利用Lipofectamine 3000将重组质粒和辅助质粒共转染GP2-293细胞进行病毒包装。在荧光显微镜下观察转染效果，收集、浓缩病毒上清液。将制备好的逆转录病毒感染HCD57细胞，采用甲基纤维素半固体培养基筛选单克隆稳定转染细胞株，采用流式细胞术鉴定c-kit基因表达。采用CCK-8法进行小分子靶向药物筛选实验。结果 酶切鉴定结果显示，电泳后重组质粒单酶切后可见约为693、2250和6 488 bp大小的3条DNA条带，与载体及c-kit基因片段大小相符；DNA测序结果显示，c-kit基因成功插入到逆转录病毒表达载体中。流式细胞术检测结果显示，感染后的HCD57单克隆细胞株高表达C-kit蛋白。CCK-8细胞增殖实验显示，伊马替尼对HCD57-c-kit-D816V细胞的生长无明显抑制作用，帕博西尼、达沙替尼、艾德拉尼均对HCD57-c-kit-D816V细胞抑制作用明显。结论 逆转录病毒载体介导C-kit蛋白稳定表达的HCD57细胞系构建成功，药物初筛实验成功，可用于抗癌小分子药物筛选实验。
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