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摘要
【背景】柑橘溃疡病(Citrus canker)是由黄单胞杆菌柑橘致病变种(Xanthomonas citri subsp. citri,Xcc)引起的危害严重的柑橘病害之一，目前尚无根治方法，而现有栽培品种中很少有对柑橘溃疡病存在显著抗性的品种，因此，抗病品种的选育对根治该病害尤其重要，而抗性基因的发掘又非常利于抗病育种。【目的】以枸橼C-05的抗溃疡病相关基因CmPR4A为诱饵，筛选其上游转录因子，探究转录因子参与调控枸橼C-05抗溃疡病的功能作用，为选育柑橘抗病品种提供基因信息。【方法】基于前期冰糖橙和枸橼C-05叶片接种Xcc的转录组测序结果，结合实时荧光定量PCR分析PR4A在抗病和感病种质中的表达差异，使用Plant CARE对枸橼C-05(抗病)和冰糖橙(感病)PR4A启动子序列进行差异分析，利用酵母单杂交筛选PR4A上游转录因子，并使用酵母回转验证、双荧光素酶验证CmPR4A和候选转录因子的互作关系。在8种抗病和感病柑橘种质中，人工接种Xcc后，于0、2、4、6和8 d时取注射点附近的叶片，对转录因子的表达水平进行分析，验证其与抗病的关系。通过农杆菌介导瞬时转化法，将带有35S启动子的转录因子载体在枸橼C-05和冰糖橙叶片中瞬时过表达，使用q RT-PCR对转录因子和PR4A表达水平进行分析，并在瞬时过表达24 h后接种Xcc，进行Xcc菌定量和症状观察。【结果】接种Xcc的枸橼C-05和冰糖橙的转录组分析及定量PCR表达结果显示，在接种4、6和8 d时，抗病种质枸橼C-05中的PR4A表达量显著高于感病的冰糖橙。枸橼C-05和冰糖橙的PR4A启动子在-236 bp处存在顺式作用元件W-box的差异，以此为依据进行CmPR4A启动子短截并构建诱饵载体。依据自激活结果，在200 ng·mL-1的金担子素(Ab A)浓度下，以pro CmPR4A-2为诱饵，在枸橼C-05受Xcc诱导下的酵母文库中进行酵母单杂交筛选，表明CmWRKY75可以与pro CmPR4A-2互作，双荧光素酶报告系统也证实二者的互作关系，且CmWRKY75正调控CmPR4A的表达。在8种柑橘种质叶片接种Xcc后进行WRKY75的表达模式分析表明，WRKY75表达量在抗病种质枸橼C-05、美国枸橼AV、矮果香橼中显著上调，在感病种质冰糖橙、沙田柚及柠檬、南川香橼和丹娜香橼中只出现微量上调。在枸橼C-05和冰糖橙叶片中瞬时过表达WRKY75，发现PR4A的表达量在接种4 d时显著上调且能增强叶片对Xcc的抗性。【结论】CmWRKY75可以结合到CmPR4A启动子的W-box上，并正调控CmPR4A的表达，增强叶片对Xcc的抗性。同时WRKY75的表达受Xcc诱导，在抗病种质中呈显著上调表达，与PR4A在抗病感种质中的表达变化趋势一致，可能是上游调控因子WRKY75在不同抗病和感病柑橘种质中表达差异导致，从而使其在枸橼C-05抗溃疡病过程中起作用。
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