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摘要
本研究旨在构建含小鼠PKM1基因的慢病毒过表达载体,筛选稳定过表达PKM1的C2C12细胞株,初步检测PKM1对细胞糖酵解的影响。提取小鼠背最长肌总RNA并反转录合成cDNA。用"Golden Gate"法构建带FLAG标签的PKM1表达载体并转染293T细胞,进行慢病毒包装并检测慢病毒滴度。转染C2C12细胞并优化转染条件,根据载体携带的抗性基因puro,用嘌呤霉素筛选稳转株。通过qPCR和Western Blot从转录水平和翻译水平检测目的基因的表达。通过测定细胞培养基的pH、乳酸含量以及葡萄消耗量检测PKM1对糖酵解的影响。结果表明小鼠PKM1基因慢病毒载体构建成功,慢病毒滴度为3.4×108 TU/mL。慢病毒侵染靶细胞的最佳感染复数为30,筛选稳转细胞株所用嘌呤霉素的最佳浓度为1.2μg/mL。显微镜下观察病毒转导效果良好,荧光率达80%以上。过表达组中FLAG-PKM1的mRNA表达量约是空载体组的9.4万倍。FLAG-PKM1融合蛋白成功在宿主细胞内表达。与野生型组和空载体组相比,过表达组细胞培养基的乳酸含量增加,葡萄糖消耗量增加,pH降低,表明细胞糖酵解加剧。本研究成功构建了含小鼠PKM1基因的稳转株,为深入研究PKM1翻译后修饰对其自身酶活以及细胞糖酵解的影响提供了材料。
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