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摘要
5’ cDNA末端快速扩增(5’ rapid amplification of cDNA ends, 5’ RACE)技术是基因转录表达调控研究的关键手段之一，其操作复杂，对样品要求较高。牛(Bos taurus)脂肪组织杂质含量高，单位体积RNA含量低，经常造成5’ cDNA末端扩增的失败，影响脂肪沉积分子机制的研究。Kruppel样因子4(Kruppellike factor 4, KLF4）是调控牛脂肪沉积的关键基因，为了准确鉴定牛KLF4基因在脂肪组织中表达的转录起始位点，揭示脂肪沉积关键基因的表达调控机理，以郏县红牛皮下脂肪组织为研究对象，对经典5’ RACE技术进行改进。首先采用特异性反转录引物，仅反转录总RNA中的特定mRNA，以提高目标基因的反转效率，耐受更低浓度的RNA；然后，调整反转录体系，简化加尾前cDNA纯化步骤，减少目标cDNA的损失，保证后续RACE扩增中的模板浓度；最后，采用适当靠近mRNA 5’端的基因特异性引物(产生较短的RACE片段)，降低RACE扩增中聚合酶延伸能力，模板二级结构等因素的干扰。通过上述改进措施，成功获得了KLF4基因的RACE片段。对该片段进行测序和比对分析后，发现郏县红牛KLF4基因的转录起始位点与NCBI数据库中以胞嘧啶C作为起始核苷酸的KLF4基因(NM＿001105385)不同，其向5’端延伸了2个碱基(GA)，以鸟嘌呤作为起始核苷酸，该结果更符合转录起始位点通常为一个嘌呤(A或G)的特征。分析不同长度RACE片段对PCR扩增的影响，结果发现较短的RACE片段(<500 bp)可以顺利扩增成功；而对于大于1 000 bp的RACE片段，试剂盒法和优化法均没有获得有效片段。本研究通过优化5’ RACE技术，成功鉴定了郏县红牛皮下脂肪KLF4基因的转录起始位点，该新位点证实了我国地方牛种的遗传特异性，为进一步研究该基因在脂肪沉积中的作用提供了参考。
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