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摘要
[目的] 产新德里金属β-内酰胺酶-5（NDM-5）的革兰阴性耐药菌对人畜健康产生巨大威胁。本文旨在初步探究大蒜辣素对NDM-5的抑制作用及其相关作用位点，为临床开发新型β-内酰胺酶抑制剂提供理论支持。[方法] 通过AutoDock模拟分子对接，预测大蒜辣素与NDM-5的结合位点；构建突变型载体pET21a-NDM-5-C208A，测序验证无误后转入感受态大肠埃希菌BL21（DE3），通过药敏实验进行突变表型确认；采用微量肉汤棋盘法和时间杀菌曲线测定评价大蒜辣素与美罗培南对NDM-5突变型细菌的联合抑菌效果。最后，通过体外表达突变蛋白NDM-5-C208A，建立酶活性测定体系比较大蒜辣素对C208突变型NDM-5和野生型NDM-5酶活性的抑制效果。[结果] 经测序证实NDM-5的C208A突变株BL21(DE3) pET21a-NDM-5-C208A构建成功，C208A突变株恢复了对头孢类和碳青霉烯类抗生素的敏感性，且大蒜辣素与美罗培南联用的FICI由0.375增加至2，联用表现为独立作用而非协同作用；体外酶活测定结果显示NDM-5-C208A突变不仅使酶活性下降约85%，而且该位点突变导致大蒜辣素对NDM-5失去抑制作用。[结论] Cys208位点是维持NDM-5水解酶活性的关键位点，且大蒜辣素可通过与该位点结合发挥抑制酶活性的作用。该结果为大蒜辣素作为新型β-内酰胺酶抑制剂的开发和应用提供数据和参考。
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