本发明公开了一种鱼类肠道上皮细胞分离培养的方法,所述方法包括:鱼类肠道分离清洗;蛋白酶消化组织块;收集细胞,分离酶液与细胞;细胞培养。本发明首次提出了鱼类物肠道上皮细胞培养的可行方法,所述方法具有操作简单、成本低、成功率高、效率高、分离的鱼类肠上皮细胞稳定的特点,解决了肠道上皮细胞易污染的问题。