三种方法提取毛霉菌核酸效能的比较实验研究

作者：潘永圣; 蒲丹; 汪佳婕; 赵云平; 徐宏忍; 白敏凤; 许小靓; 尹利民^*

来源：现代检验医学杂志, 2023, 38(06): 148-152.

• 毛霉菌
• 核酸提取
• 实时荧光定量PCR

目的 比较改良碱裂解法、一步法和磁珠法提取毛霉菌核酸效能的差异，探索一种用于PCR扩增的快速、高效、简便、经济的毛霉菌核酸提取方法。方法 分别用改良碱裂解法、一步法和磁珠法提取黑根毛霉（Rhizomucor miehei,R.miehei）、伞枝犁头霉（Lichtheimia corymbifera,L. corymbifera）和卷枝毛霉（Mucor circinelloides,M. circinelloides）3株毛霉菌核酸，使用Qbit4核酸浓度测定仪测定核酸浓度，并进行实时荧光定量PCR扩增实验，比较其扩增后的循环阈值（Ct）差异和核酸提取效率。结果 改良碱裂解法、一步法及磁珠法均能提取R. miehei,L. corymbifera和M.circinelloides 3株毛霉菌核酸，其中一步法提取所得核酸的浓度最高，改良碱裂解法次之，磁珠法最低，差异具有统计学意义（F=38.803,2 160.759,325.175，均P<0.05）。改良碱裂解法提取毛霉菌核酸耗时最短（10.00±1.50 min），一步法次之（25.00±1.50 min），磁珠法最长（75.00±1.50 min），差异有统计学意义（F=2 574.074,P<0.01）。磁珠法提取毛霉菌核酸耗费成本和设备依赖度最高，其次是一步法次之，改良碱裂解法最低。改良碱裂解法、一步法及磁珠法提取的3株毛霉菌核酸均能扩增出阳性结果。三种方法提取R. miehei菌株核酸扩增后Ct值分别为18.72±0.18,17.42±0.46和18.97±0.46，差异有统计学意义（F=22.375,P<0.01），其中改良碱裂解法和磁珠法提取的核酸扩增后Ct值差异无统计学意义（t=1.114,P>0.05），一步法提取的核酸扩增后的Ct值小于另外两种方法，差异有统计学意义（t=5.852,5.277，均P<0.05）。提取L. corymbifera菌株核酸扩增后Ct值分别为16.23±0.13,21.23±0.25和14.53±0.04，差异有统计学意义（F=2 298.548,P<0.01），其中改良碱裂解法提取的核酸扩增后的Ct值小于一步法，差异有统计学意义（t=40.031,P<0.01），磁珠法提取的核酸扩增后的Ct值小于另外两种方法，差异有统计学意义（t=27.953,60.265，均P<0.05）。提取M. circinelloides菌株核酸扩增后Ct值分别为16.77±0.28,15.38±0.88和16.13±0.20，差异有统计学意义（F=8.152,P<0.01），其中改良碱裂解法提取的核酸产物扩增后的Ct值大于另外两种方法，差异有统计学意义（t=3.372,4.106，均P <0.05），一步法和磁珠法提取的核酸产物扩增后的Ct值差异无统计学意义（t=1.866,P> 0.05）。结论 改良碱裂解法、一步法及磁珠法均可成功提取毛霉菌核酸，其中改良碱裂解法操作简便、耗时最短、耗费成本和设备依赖性最低，所提取毛霉菌核酸模板能够满足实时荧光定量PCR扩增要求。

• 单位
  昆明市第一人民医院