基于MS2噬菌体病毒样颗粒的RT-PCR检测新型冠状病毒(SARS-CoV-2)质控品制备

作者：王国强; 于茵茵; 曾华辉; 王旭东; 吴玉彬; 尚立芝; 李玉林; 张怡青; 张西西; 张振强^*; 王云龙^*

来源：中国生物工程杂志, 2020, 40(12): 31-40.

DOI：10.13523/j.cb.2009008

• 新型冠状病毒(2019)
• MS2噬菌体
• 盔甲RNA
• 病毒样颗粒

目的:制备热稳定性好、耐RNase攻击及可全程监控操作的核酸检测新型冠状病毒阳性质控品。方法:分别扩增MS2噬菌体外壳蛋白CP(含PAC位点)基因以及成熟酶蛋白A基因序列(含核糖体结合位点),先后插入质粒pET28a多克隆位点不同位置,构建通用重组载体pET28a/CP-A。合成包含ORF1ab基因、N基因和E基因三个靶标的特定核酸序列,插入到重组载体pET28a/CP-A中PAC位点的下游,构建包含靶序列的重组载体pET28a/CP-A/S。通过原核表达系统表达目的蛋白,采用硫酸铵和凝胶过滤层析进行纯化,利用透射电镜和动态光散射对蛋白质进行物理表征。全能核酸酶消化形成的盔甲RNA,通过RT-PCR检测其残余核酸和热稳定性。结果:成功构建包含MS2噬菌体外壳蛋白CP基因、成熟酶蛋白A基因和外源靶核酸的重组载体,目的蛋白在25℃、IPTG 0.3mmol/L、诱导14h时以可溶性形式得到高效表达,纯化后,得到了大小均一、直径为23～28nm的病毒样颗粒,经核酸酶消化后RT-PCR检测,颗粒溶液中几乎无核酸残余且形成了包封靶基因的盔甲RNA。加速破坏试验表明该盔甲RNA无菌过滤后可在37℃稳定保持10天。结论:在体外,利用MS2噬菌体外壳蛋白和成熟酶蛋白自组装包封外源靶序列制备的盔甲RNA,其热稳定性好,可全程监控整个检测过程,可作为核酸检测SARS-CoV-2的定性或定量质控品。

• 单位
  河南省职工医院; 河南师范大学; 河南中医药大学; 郑州职业技术学院