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摘要
目的 构建一种特异性标记过氧化物酶体的GFP腺病毒载体。方法 设计含过氧化物酶体信号肽的GFP序列，PCR法扩增该序列片段，并将其与腺病毒穿梭质粒载体pAdTrack连接，然后将连接产物转化到大肠埃希菌DH5α感受态细胞中获得重组质粒并测序鉴定。重组质粒经限制性内切酶PmeⅠ酶切线性化后，转化到含腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的BJ5183感受态细胞中进行同源重组。重组腺病毒质粒经限制性内切酶PacⅠ酶切线性化后感染293A细胞，进行病毒包装，得到含过氧化物酶体信号肽的Ad-GFP-Peroxi重组腺病毒颗粒。用腺病毒Ad-GFP-Peroxi和不含过氧化物酶体信号肽的腺病毒Ad-GFP感染培养的大鼠心肌细胞H9C2,48 h后在荧光显微镜下观察绿色荧光强弱。将用Ad-GFP-Peroxi腺病毒感染的H9C2细胞分为正常培养组和1%O2浓度培养组，培养24 h后于共聚焦显微镜下观察，并进行荧光信号聚集情况分析。结果 含过氧化物酶体信号肽的GFP腺病毒载体构建成功。与不含过氧化物酶体信号肽的腺病毒Ad-GFP相比，含过氧化物酶体信号肽的腺病毒Ad-GFP-Peroxi能够特异性显示大鼠心肌细胞H9C2内过氧化物酶体的分布，且缺氧培养的H9C2细胞内过氧化物酶体分布出现聚集现象。结论 利用同源重组方法成功构建了过氧化物酶体特异性GFP腺病毒，其对大鼠心肌细胞H9C2有较高的感染效率，共聚焦显微镜下可以明确显示心肌细胞内过氧化物酶体的分布情况。
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单位中国人民解放军第二军医大学; 第一附属医院心血管内科; 中国人民解放军总医院
