重组肌氨酸氧化酶的制备和鉴定

作者：蒲静; 王瑞; 姚明东; 何中杰; 赵明; 孟尧

来源：生物医学工程学杂志, 2014, 31(05): 1090-1096.

• 重组肌氨酸氧化酶
• 诱导表达
• 高密度发酵

测定血清中肌酐的浓度是临床上诊断肾功能的一项重要指标。在利用偶联酶法测定的过程中,一种关键酶——肌氨酸氧化酶(SOX)(EC 1.5.3.1)的质量控制是我们首先要解决的一个重要问题。本文利用乳糖诱导重组肌氨酸氧化酶(r-SOX)基因在E.coli中高效表达,经300L发酵罐发酵培养,菌体终密度达到OD600值22,菌体湿重达30g/L,湿菌体含活性20U/g。重组肌氨酸氧化酶表达量占菌体可溶性蛋白的25%左右。菌体破碎液经55℃选择性热变性处理和Ni-Sepharose FF层析二步纯化,经十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析酶的纯度达97%以上,比活力达25U/mg,纯化倍数为14.4,活性收率为92.4%。纯化的酶经SDS-PAGE和分子筛层析法测定,其分子量分别为53kD和55kD,提示该酶结构为单一肽链。纯化的酶液和冻干粉均呈黄色,经三氯乙酸和热变性处理,发现其与核黄素以共价键的方式结合。此外,对该酶的稳定性和其中的干扰酶过氧化氢酶也做了进一步的考察。以上所取得的研究结果为此酶的开发和利用奠定了基础。

• 单位
  成都医学院; 成都医学院第一附属医院