海分枝杆菌embA低表达菌株的构建及巨噬细胞侵染实验

作者：李烨雨; 刘含梅; 黄滢睿; 郭滨; 张鹭

来源：复旦学报(自然科学版), 2023, 62(05): 585-594.

DOI：10.15943/j.cnki.fdxb-jns.20220819.001

• 海分枝杆菌
• embA
• 巨噬细胞
• 髓样分化因子88
• F-actin

通过CRISPRi基因编辑技术构建阿拉伯糖基转移酶基因A(embA)低表达海分枝杆菌突变株，利用qRT-PCR技术检测相关基因转录水平。突变株侵染巨噬细胞后，台盼蓝染色测定细胞存活率，稀释涂布法检测胞内活菌数量。免疫荧光染色观察感染后巨噬细胞中F-actin细胞骨架重排和吞噬小泡的形成。分别通过Western blot和细胞因子悬液芯片方法验证小鼠巨噬细胞J774A.1胞内髓样分化因子88(Myeloid Differenti-ation factor, MyD88)表达量和细胞因子分泌。结果显示：对数生长中期野生型海分枝杆菌中glfT2和embA基因表达量增加。embA低表达突变株中embB,glfT2等6个阿拉伯半乳聚糖合成基因显著下调，但菌体形态和长度不变。与对照菌株相比，突变株侵染J774A.1巨噬细胞24 h后，细胞存活率和胞内CFU上升，吞噬小泡和骨架蛋白无明显变化。胞内MyD88蛋白表达水平增加，分泌性炎症因子TNF-α、IL-6和趋化因子RANTES、MIP-1α水平上升。本研究提示，embA表达量下降会降低海分枝杆菌的细胞毒力，但不会直接改变巨噬细胞吞噬病原菌的生理过程。

• 单位
  遗传工程国家重点实验室; 生命科学学院; 复旦大学; 基础医学院