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摘要
帕金森病（Parkinson disease，PD）是最常见的神经退行性运动障碍疾病，其病理上以多巴胺神经元的丢失和黑质致密部存活神经元胞质内包含体-路易小体（Lewy bodies，LBs）为特征，并伴有营养缺陷型神经突-路易神经突（Lewy neuritis，LNs）。虽然围绕路易小体的研究有很多，但是对其生成的机制仍不甚清楚。Alpha-synuclein（α-syn）和泛素（Ub）是路易小体和路易神经突的主要蛋白成分。α-SYN是被鉴定的第一个PD致病基因。α-SYN基因与PD相关的三种突变促成少见的家族型PD发生。在PD、路易小体痴呆（dementia with LBs，DLB）、多系统萎缩（multiple system atrophy，MSA）和青年发病的神经轴性营养不良（juvenile onset neuroaxonal dystrophy）中均发现α-syn的沉积。这些疾病被称为synuclein病，提示α-syn可能在这些神经退行性疾病中起共同的作用。在synuclein病病人脑组织以及转基因动物中，α-syn的129位丝氨酸（S129）受到广泛地选择性地磷酸化。该磷酸化是α-syn的毒性作用的关键，并引导α-syn的泛素化。路易小体中几乎90％的α-syn的129位丝氨酸（S129）被磷酸化，但129位丝氨酸磷酸化的α-syn在路易小体形成中的作用机制仍不清楚。我们将α-syn的129位丝氨酸突变为天冬氨酸构建了模拟129位丝氨酸持久磷酸化状态的α-syn突变体（S129D）。当和泛素共同表达于Neuro2a细胞后，相比对照载体和野生型α-syn（WT），S129D促成更多泛素结合物，并导致胞质泛素化包含体的形成。而与63位赖氨酸突变的泛素共表达时，S129D-α-syn不再促进泛素结合物和形成泛素包含体。在去血清和双氧水处理的neuro2a细胞中，S129D-α-syn比野生型α-syn形成更多胞质和神经突内的聚集。这些结果提示129位丝氨酸磷酸化的α-syn可能通过促进泛素63位赖氨酸链接物和自身聚集的形成参与帕金森病以及其它相关疾病中路易小体的形成。 严重抑郁（Major depression，MD）是一种常见病，它治疗费用昂贵，可反复发作。并且有较高的发病率和死亡率。人们预测，到2020年，MD将成为仅次于缺血性心脏病的全球性第二大主要疾病。许多研究表明免疫系统的变化与MD相互间有着密切的关联。诸如白介素-1（interleukin-1，IL-1），肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factorα，TNF-α）和干扰素-γ，（interferon-γ，IFN-γ）等炎性细胞因子水平的升高意味着免疫系统的激活，而免疫系统的激活与MD有关。由于其对神经递质、神经内分泌以及MD相关行为的作用，炎性细胞因子被认为在MD的病理生理学中起重要作用。树突状细胞（Dendritic cells，DCs）是功能最强大的抗原递呈细胞（Antigen presenting cell，APC），其最大的特点就是能够刺激初始型T细胞（Naive T cells）增殖，是机体免疫系统反应的启动者，具有调节免疫激活和免疫耐受的平衡功能，在免疫应答过程中起着重要的作用，近年来被研究用于移植免疫耐受和肿瘤免疫治疗。树突状细胞核蛋白1（dendritic cell nuclear proteinl，DCNP1）是由244个氨基酸组成的蛋白，在成熟DCs中高表达，主要分布与脑及骨骼肌，定位于成熟DCs的核周，与DCs和巨噬细胞的标记蛋白CD68存在共同的分布。最近的研究提示DCNP1是一个MD候选基因，其突变体会导致DCNP1蛋白在第117个氨基酸提前终止，与MD发病相关。而DCNP1参与MD发病的分子机制尚未见报道。DCs的免疫调节功能是否与MD相关，DCNP1又如何参与MD都有待研究。为进一步探索DCNP1与MD的联系，我们自人HEK293细胞克隆了DCNP1基因，构建了原核表达载体和真核表达载体。在体外，His-tag融合DCNP1（His-DCNP1）在大肠杆菌成功表达，并用于多克隆抗体制备。在哺乳动物细胞中，EGFP融合DCNP1野生型（DCNP1-EGFP）和N端突变体DCNP1（1-116）-EGFP，C端突变体DCNP1（117-244）-EGFP以及核定位信号（NLS）缺失突变体DCNP1（RRK）-GFP均有较好表达。荧光观察结果显示，DCNP1-EGFP定位在哺乳动物细胞核。核定位信号117RRK119缺失后，DCNP1（ΔRRK）-EGFP在293FT细胞中呈明显胞质分布，而在Neuro2a细胞中呈现核、质分布。DCNP1（1-116）-EGFP在293细胞和Neuro2a细胞中均呈现核、质分布。而DCNP1（117-244）-EGFP在293细胞和Neuro2a细胞中核定位能力减弱。我们的结果提示DCNP1是一个核蛋白，其117到119位氨基酸“117RRK119为一NLS。我们推测DCNP1病理相关突变体参与MD的发病的机制可能与其核定位改变有关。我们的上述研究为深入研究DCNP1和MD的关系提供了线索。
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