奶牛乳腺上皮细胞中bta-miR-29b实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用

作者：潘晓乐; 扈登强; 穆爱娟; 马继贤; 周学章; 韩博; 王东^*

来源：中国兽医科学, 2021, 51(11): 1369-1375.

DOI：10.16656/j.issn.1673-4696.2021.0194

• 实时荧光定量PCR
• 金黄色葡萄球菌
• 奶牛乳腺上皮细胞
• bta-miR-29b

为了检测金黄色葡萄球菌(S. aureus)感染的奶牛乳腺上皮细胞(bMECs)中bta-miR-29b表达,本研究建立bta-miR-29b实时荧光定量PCR(RT-qPCR)方法,并对该方法的特异性、敏感性和重复性进行评估,利用该方法检测金黄色葡萄球菌感染bMECs中bta-miR-29b的表达水平。结果显示,构建的RT-qPCR方法在bta-miR-29b标准品10 pg/20μL～1×10-4pg/20μL浓度范围内,初始模板量和Ct值之间呈现良好的线性关系,线性相关系数R2=0.999 7。特异性试验结果显示,对bta-miR-29b标准品样本检测结果为阳性,对牛大肠杆菌和链球菌样本检测结果均为阴性,说明该方法特异性强;敏感性试验结果显示,对bta-miR-29b标准品的最低检测模板浓度为1×10-4pg/20μL,比常规PCR检测的敏感性高100倍,表明该方法敏感性高;重复性试验结果显示,组内和组间的变异系数均小于1%,说明该方法重复性好。临床样本的检测结果显示,金黄色葡萄球菌感染bMECs后第24小时bta-miR-29b的表达量极显著下调(P<0.01)。上述结果表明,本研究建立的RT-qPCR方法特异性强、敏感性高、重复性好,能够准确检测金黄色葡萄球菌感染bMECs中bta-miR-29b的表达,为今后bta-miR-29b的表达分析及其生物学功能的研究提供了研究手段。

• 单位
  宁夏大学; 中国农业大学; 生命科学学院