miR-92a-3p在小鼠胚胎神经管闭合中的作用及机制

作者：张燕秋; 付佳琳; 黄琬淇; 袁正伟; 顾卉^*

来源：发育医学电子杂志, 2023, 11(04): 241-248.

• 神经管畸形
• 细胞迁移
• miR-92a-3p
• 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4

目的探讨miR-92a-3p与烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase 4,NOX4)之间的相互作用,以及两者在神经管畸形(neural tube defect,NTD)中对细胞迁移的影响。方法 实验动物采用C57BL/6J小鼠,孕鼠随机分为NTD组与对照组,每组30只,NTD组采用全反式维A酸(all-trans retinoic acid,ATRA)诱导NTD模型,于E9.5采集胚胎样本。实验所用细胞系为小鼠神经干细胞C17.2,转染NOX4过表达质粒、miR-92a-3p模拟物/抑制剂、模拟物对照/抑制剂对照。采用实时定量PCR(real-time quantitative PCR,RT-qPCR)检测胚胎和C17.2细胞中miR-92a-3p表达,采用蛋白质印迹法检测NOX4的表达。通过双荧光素酶报告基因实验明确miR-92a-3p对NOX4的结合及靶向调控关系。采用细胞划痕实验与Transwell实验观察miR-92a-3p和NOX4对细胞迁移活动的影响。统计学方法采用单因素方差分析、独立样本t检验。结果 NTD组胚胎miR-92a-3p表达低于对照组(0.753±0.052与1.006±0.126,t=3.212,P=0.033),NOX4蛋白表达高于对照组(0.870±0.039与0.688±0.056,t=4.621,P=0.010)。在转染NOX4 3’端非翻译区(3’ untranslated regions,3’UTR)荧光素酶报告基因的C17.2细胞中,共转染miR-92a-3p模拟物组的荧光素酶活性低于模拟物对照组(0.368±0.102与1.000±0.149,t=5.530,P=0.005);共转染miR-92a-3p抑制剂组的荧光素酶活性高于抑制剂对照组(1.254±0.080与1.000±0.129,t=2.899,P=0.044)。C17.2细胞转染miR-92a-3p模拟物组,NOX4的蛋白表达低于模拟物对照组(1.077±0.142与1.432±0.300,t=2.396,P=0.044);转染miR-92a-3p抑制剂组,NOX4的蛋白表达高于抑制剂对照组(1.443±0.054与1.249±0.090,t=3.709,P=0.010)。细胞划痕的实验结果表明,转染NOX4质粒后,细胞伤口愈合的速度低于对照组[(8.8±6.5)%与(44.1±6.8)%,t=6.513,P=0.003],然而当过表达NOX4的同时转染miR-92a-3p,与转染NOX4组比较,细胞伤口愈合速度加快[(37.2±11.7)%与(8.8±6.5)%,t=3.680,P=0.021]。Transwell实验发现,转染NOX4质粒后,迁移的细胞数量低于对照组[(102.7±4.5)与(133.0±11.8)个,t=4.162,P=0.014],而共转染NOX4与miR-92a-3p后,与转染NOX4组比较,发生迁移的细胞明显增多[(176.0±11.0)与(102.7±4.5)个,t=10.680,P<0.001]。结论 小鼠NTD模型中,异常低表达的miR-92a-3p能够通过上调NOX4的表达,阻碍小鼠胚胎神经管闭合过程中细胞的迁移活动,最终导致NTD的发生。

• 单位
  中国医科大学附属盛京医院