梨愈伤组织双靶点CRISPR/Cas9基因编辑系统的建立

作者：杨锋; 杨钦淞; 高雨豪; 马云晶; 许英; 滕元文; 白松龄^*

来源：园艺学报, 2021, 48(05): 873-882.

DOI：10.16420/j.issn.0513-353x.2020-1829

• 梨
• 愈伤组织
• 基因编辑
• 多靶点
• CRISPR/Cas9

为了在梨愈伤组织中建立CRISPR/Cas9基因编辑体系,将proDAM3:GUS转入‘茄梨’愈伤组织,通过构建双靶点的CRISPR/Cas9基因编辑载体,利用农杆菌介导的遗传转化法侵染proD AM3:GUS转基因梨愈伤组织,通过测序及GUS染色的方法检验敲除效果,分析靶基因突变类型。结果表明,共有4个转基因株系在靶位点处发生了基因突变,编辑效率为66.7%。对所有基因编辑株系的有效克隆进行分析,结果显示sgRNA1在靶位点GUST1的突变频率达到71.4%,高于sgRNA2在靶位点GUST2突变频率的46.4%,说明sgRNA1可以更有效地与靶位点结合。测序结果表明,4个基因编辑株系中GUS基因均被敲除,基因突变的类型包含碱基缺失、插入及两个靶点之间大片段的缺失,不存在碱基替换。GUS染色结果显示,基因敲除后的GUS转基因愈伤完全呈白色,说明利用CRISPR/Cas9多靶点基因编辑系统可以在梨愈伤组织中实现高效的基因敲除。

• 单位
  农业部; 浙江大学