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摘要
背景:人羊膜间充质干细胞具有多向分化能力,相关研究表明Scleraxis和碱性成纤维细胞生长因子均能够促进人羊膜间充质干细胞向人韧带成纤维细胞定向分化。目的:探讨Scleraxis联合碱性成纤维细胞生长因子促进人羊膜间充质干细胞向人韧带成纤维细胞分化的效果。方法:经遵义医学院附属医院伦理委员会批准,术前签署知情同意书,取足月产胎盘羊膜组织,两步酶消化法分离人羊膜间充质干细胞,倒置相差显微镜观察细胞形态;苏木精-伊红染色观察新鲜人羊膜结构;取第3代人羊膜间充质干细胞分4组进行培养:①单纯人羊膜间充质干细胞培养组;②人羊膜间充质干细胞经Slclerxis基因慢病毒感染组;③人羊膜间充质干细胞经碱性成纤维细胞生长因子诱导组;④人羊膜间充质干细胞经Scleraxis和碱性成纤维细胞生长因子联合诱导组。细胞培养3d开始采用CCK-8法检测各组细胞增殖能力;细胞培养14 d后,实时荧光定量PCR评价各组细胞向人韧带成纤维细胞定向分化的效果。结果与结论:①第3代人羊膜间充质干细胞呈长梭形、涡旋状贴壁生长;②新鲜人羊膜呈明显的分层结构,共分为5层:上皮层、基底层、致密层、纤维母细胞层和海绵层;③人羊膜间充质干细胞经Scleraxis基因慢病毒感染24h后表达绿色荧光,荧光表达量较强且稳定;经过碱性成纤维细胞生长因子诱导后14d的形态近似于人韧带成纤维细胞;④CCK-8实验结果显示:4组细胞均呈S型生长,其中Scleraxis基因慢病毒感染组、碱性成纤维细胞生长因子诱导组、联合诱导组较单纯培养组增殖能力强(P <0.05),但这3组间的增殖能力差异无显著性意义(P> 0.05);⑤实时荧光定量PCR显示:Scleraxis基因慢病毒感染组、碱性成纤维细胞生长因子诱导组、联合诱导组韧带相关基因Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、Fibronectin、Tenascin-C、TNMD的m RNA表达量均高于单纯培养组(P <0.05),联合诱导组上述韧带相关基因的mRNA表达量高于Scleraxis基因慢病毒感染组和碱性成纤维细胞生长因子诱导组(P <0.05);⑥结果表明,Scleraxis基因和碱性成纤维细胞生长因子联合促进人羊膜间充质干细胞向人韧带成纤维细胞分化,为韧带损伤修复治疗提供了新的思路。
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