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摘要
目的 :探讨一种新的CD44剪切变异体16(CD44 variant 16,CD44v16)对乳腺癌细胞多柔比星(doxorubicin,DOX)耐药性的影响及其机制。方法 :利用慢病毒感染法构建CD44v16过表达的MCF7细胞株(命名为MCF7-CD44v16),以及CD 44v 16基因沉默的MCF7/DOX细胞株(命名为MCF7/DOX-sh CD44v16)。采用CCK-8法检测DOX对各组细胞的半数抑制浓度(half maximal inhibitory concentration,IC50),以及在相同浓度DOX处理后细胞的生长情况。采用罗丹明潴留实验检测各组细胞中罗丹明潴留率。采用实时荧光定量PCR法检测各组细胞中乳腺癌耐药相关基因的表达变化。采用蛋白质印迹法检测各组细胞中自噬相关蛋白的表达水平。用自噬抑制剂氯喹(30 nmol/L)处理各组细胞后,再次采用CCK-8和实时荧光定量PCR法分别检测各组细胞的DOX IC50值和耐药相关基因的表达变化。结果 :成功构建慢病毒稳定感染的MCF7-CD44v16和MCF7/DOX-sh CD44v16细胞株。DOX对各组细胞的IC50值存在明显差异(P <0.05)。DOX作用下MCF7-CD44v16细胞生长活性较MCF7细胞高(P <0.05),相反MCF7/DOX-shCD44v16细胞生长活性较MCF7/DOX细胞低(P <0.05)。MCF7-CD44v16细胞中罗丹明平均荧光强度低于MCF7细胞(P <0.05),而MCF7/DOX-shCD44v16细胞中罗丹明潴留率高于MCF7/DOX细胞(P <0.05)。与对照组MCF7细胞相比,MCF7-CD44v16细胞中CD44v16过表达,多药耐药相关蛋白1(multidrug resistance-associated protein 1,MRP1)、肺耐药蛋白(lung resistance protein,LRP)和切除修复交叉互补基因1(excision repair cross-complementing gene 1,ERCC1)的mRNA表达水平明显上调(P值均<0.01),微管相关蛋白1轻链3Ⅱ(microtubule-associated protein 1 light chain 3Ⅱ,LC3Ⅱ)及Bcl-2同源结构域蛋白1(Beclin-1)表达水平也明显升高(P值均<0.01);而与对照组MCF7/DOX细胞株相比,MCF7/DOX-shCD44v16细胞株中CD44v16表达下调后,MRP1、LRP、ERCC1、谷胱甘肽-S-转移酶π亚型(glutathione-S-transporter-π,GST-π)及多药耐药基因1(multidrug resistance 1,MDR1)的mRNA表达水平明显降低(P值均<0.01),且LC3Ⅱ和Beclin-1蛋白表达水平也明显下调(P值均<0.05)。与未加氯喹的对照组细胞相比,自噬抑制剂氯喹处理后各组细胞的IC50值均有所下降(P值均<0.05),耐药相关基因MRP1、LRP和ERCC1的表达水平也明显降低(P值均<0.05)。结论 :CD44v16能够增强乳腺癌细胞对化疗药物DOX的耐药性,其机制可能与促进细胞自噬有关。
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单位江苏大学; 中心实验室
