新型天冬氨酸激酶突变株构建及酶学性质表征

作者：樊占青; 刘晓婷; 魏贞; 王哲人; 王亚南; 高欣; 闵伟红^*

来源：食品科学, 2022, 43(02): 62-69.

• 天冬氨酸激酶
• 定点突变
• 酶活力
• 分子动力学模拟
• 酶学性质

通过定点随机突变技术,提高天冬氨酸代谢途径中首个关键限速酶天冬氨酸激酶(aspartate kinase,AK)的催化活力,减弱或解除代谢产物对其协同反馈抑制,并通过Discovery Studio等软件对其空间结构进行分析,借助分子动力学模拟对其机制进行分析。首先选择ATP附近关键残基位点,在前期T379N/A380C/G171I突变株的基础上进行突变株构建,然后通过高通量筛选,获得酶活力显著提高的突变株T379N/A380C/G171I/S227D。动力学分析显示,Vmax值增至242.05 U/(mg·min),较T379N/A380C/G171I突变株(187.88 U/(mg·min))提高到1.28倍,较野生型(wild type,WT)AK(3.01 U/(mg·min))提高到80.41倍;Km值减小为1.35 mmol/L,底物亲和力增大。最后通过Discovery Studio软件和分子动力学模拟分析发现,突变后体系状态稳定,与ATP的氢键占有率增加,与底物的结合稳定性增强,有利于催化反应进行。酶学性质研究表明:该突变株T379N/A380C/G171I/S227D的最适反应温度增至30℃,较WT和T379N/A380C/G171I分别提高5℃和2℃;最适pH值为8.5,较T379N/A380C/G171I(pH 9.0)减小0.5;半衰期为3.9 h,较T379N/A380C/G171I延长0.8 h;且在不同浓度抑制剂Lys、Thr和Met以及Lys+Thr、Lys+Met、Thr+Met和Lys+Thr+Met不同组合存在情况下,该突变株表现出明显的激活作用,抑制效果减弱显著,激活作用最高143.35%。

• 单位
  吉林农业大学