编辑PFF细胞的P53基因及其信号通路中重要基因的表达分析

作者：乔传民; 刘为伟; 杨强; 江浩筠; 黄路生; 幸宇云^*

来源：畜牧兽医学报, 2019, 50(11): 2215-2225.

• CRISPR-Cas9
• 猪
• P53
• 单链寡核苷酸
• 基因编辑

旨在编辑PFF细胞的P53基因,并分析其信号通路中重要基因的表达。本研究首先将设计好的两条sgRNAs装载入PX459 V2.0质粒中,订购两条携带241W、242S、266H突变位点的单链寡核苷酸(SSODN)作为供体DNA(一条带有前两个突变,另一条带有266H突变),利用电转法将打靶载体和SSODNs共转染到PFF细胞中,筛选单克隆细胞后检测打靶区域的编辑情况,并检测编辑细胞中信号通路重要基因(MDM2、FAS、WIP1、BAX、P21和DD1α)的表达及检测编辑细胞的增殖能力。结果表明,在筛选到的107个单克隆细胞中,分别有4个为两个位点(R241和R242)纯合子和杂合子编辑型,1个为R266位点纯合子编辑型、63个纯合子缺失型、11个序列倒置型、11个纯合子点插入型、3个杂合子缺失型(或混合克隆)和10个野生型,未获得3个位点同时被编辑的细胞。RT-PCR和Western blotting结果显示,纯合子缺失型细胞中P53几乎不表达;RT-PCR检测显示,在纯合子缺失型细胞和双位点编辑型细胞中MDM2、FAS、BAX、P21基因的表达量极显著下降(P<0.01或P<0.001);Western blotting结果显示,在纯合子缺失型细胞中,未检测到P21基因的表达蛋白,MDM2的表达量也较明显地下降。CCK-8检测试验表明,编辑型细胞的增殖能力显著(P<0.05)或极显著(P<0.01或P<0.001)高于野生型细胞。综上所述,本试验成功地将PFF细胞中P53基因的两个野生型位点编辑成与人肿瘤发生相关的位点,P53基因被编辑后显著影响了其信号通路中部分重要基因的表达,本试验所获得双位点编辑细胞,为下一步研制P53点编辑模型猪奠定了重要的基础。

• 单位
  江西农业大学