鸡、鸭、鹅MC5R真核表达载体及突变型的构建及信号通路初探

作者：闵天奇; 贾琼; 韩蕊; 苏语兮; 嵇祝星; 王泽源; 刘敏; 崔子鹤; 张海洁; 肖霞; 王志强^*

来源：中国家禽, 2019, 41(01): 13-19.

DOI：10.16372/j.issn.1004-6364.2019.01.004

• 鸡
• 鸭
• 鹅
• MC5R
• 真核表达
• 报告基因检测

试验旨在构建鸡、鸭、鹅黑素皮质素受体5(Melanocortin Receptor-5,MC5R)及其突变体的真核表达载体,并比较野生型与突变体MC5R在人源胚胎肾细胞(HEK293T)中的表达及功能的差异。从三种家禽血液中分别提取全基因组DNA,以其为模板,用聚合酶链式反应(PCR)扩增目的基因编码区。用同源重组方法将扩增的目的基因片段定向插入表达载体pcDNA3.1(+)中。单点突变构建pcDNA3.1(+)-MC5Rs突变型。用脂质体法将三种禽类野生型和突变型重组质粒pcDNA3.1(+)-MC5Rs分别瞬时转染入HEK293T细胞中,用双萤光素酶报告基因法检测胞内第二信使cAMP水平的变化来反应受体的表达和激活情况。结果表明:成功构建了鸡、鸭、鹅MC5R真核表达载体与各3个突变型(D119A、F254A和H257A)。在HEK293T细胞中表达时,与野生型相比,F254A的基础活性大幅升高,D119A与H257A的基础活性变化不大;D119A与H257A对激动剂α-MSH的反应活性完全丧失,F254A对于激动剂α-MSH的反应活性降低,为进一步研究体外鸡、鸭、鹅MC5R功能奠定基础。

• 单位
  扬州大学