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摘要
目的 探讨树突状表皮T淋巴细胞(DETC)和Vγ4 T淋巴细胞对小鼠表皮细胞增殖分化的影响及其在创面愈合中的作用。方法 (1)取6只8周龄C57BL/6雄性小鼠,采用随机数字表法(分组方法下同)分为对照组和创面组,每组3只。于创面组小鼠背部剪1条长4 cm深达皮肤全层的直线切口,对照组小鼠不行任何处理。伤后3 d,断颈处死2组小鼠,取创面组小鼠背部距创缘5 mm内的皮肤,取对照组小鼠相应部位正常皮肤制成单细胞悬液,流式细胞仪检测表达白细胞介素17A(IL－17A)的Vγ4 T淋巴细胞的百分比及表达胰岛素样生长因子Ⅰ(IGF－Ⅰ)的DETC百分比。(2)取10只8周龄C57BL/6雄性小鼠,分为对照组和Vγ4 T淋巴细胞清除组,每组5只。Vγ4 T淋巴细胞清除组小鼠腹腔注射200 g亚美尼亚仓鼠抗小鼠Vγ4 T淋巴细胞单克隆中和抗体,对照组小鼠腹腔注射等量亚美尼亚仓鼠Ig,分别于背部脊柱两侧各打1个深达皮肤全层的孔,观察伤后1～8 d创面愈合情况,并计算剩余创面面积百分比。(3)取6只8周龄C57BL/6雄性小鼠,同实验(2)进行分组及处理,每组3只。伤后3 d,蛋白质印迹法检测创缘表皮组织IL－17A和IGF－Ⅰ的蛋白表达。(4)取30只3 d龄C57BL/6雄性小鼠,断颈处死后提取表皮细胞,流式细胞仪(下同)检测角蛋白14阳性细胞率。(5)另取小鼠表皮细胞,分为对照组、IGF－Ⅰ组与IL－17A组,每组3孔(下同)。IGF－Ⅰ组与IL－17A组细胞分别加入1 mL终质量浓度为100 ng/mL的重组小鼠IGF－Ⅰ和重组小鼠IL－17A,对照组细胞加入等量无菌磷酸盐缓冲液(PBS)。培养5 d后,检测角蛋白14阴性细胞率。另取小鼠表皮细胞,同前进行分组及处理,培养10 d后,检测角蛋白10阳性细胞率。(6)另取小鼠表皮细胞,加入4 mmol/L羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯(CFSE)染液,分为对照0 d组、对照7 d组、IGF－Ⅰ组、IL－17A组。IGF－Ⅰ组、IL－17A组细胞同实验(5)对应组进行处理,对照0 d组、对照7 d组细胞同实验(5)对照组进行处理。对照0 d组细胞培养0 d,余3组细胞培养7 d,检测CFSE荧光波峰位置。(7)另取小鼠表皮细胞,分为对照组、IGF－Ⅰ组。IGF－Ⅰ组细胞加入1 mL终质量浓度为100 ng/mL重组小鼠IGF－Ⅰ,对照组细胞加入等量无菌PBS,培养5 d后,同前进行角蛋白14和CFSE染色,检测CFSE阳性细胞角蛋白14阴性细胞率。另取小鼠表皮细胞,分为对照组与IL－17A组,IL－17A组细胞加入1 mL终质量浓度为100 ng/mL重组小鼠IL－17A,对照组细胞加入等量无菌PBS,培养5 d后,检测CFSE阳性细胞角蛋白14阴性细胞率。对数据行单因素方差分析和t检验。结果 (1)伤后3 d,对照组小鼠正常表皮组织中表达IGF－Ⅰ的DETC百分比为(9.9±0.8)%,明显低于创面组小鼠创缘表皮组织中的(19.0±0.6)%,t＝8.70,P<0.01；对照组小鼠正常表皮组织中表达IL－17A的Vγ4 T淋巴细胞百分比为(0.123±0.024)%,明显低于创面组小鼠创缘表皮组织中的(8.967±0.406)%,t＝21.77,P<0.01。(2)对照组小鼠伤后1～4 d创面周围有明显的炎症反应；伤后5～8 d,创面面积仍较大。Vγ4 T淋巴细胞清除组小鼠伤后1～4 d创面周围炎症反应较轻；伤后5～8 d,创面面积明显缩小。伤后3～7 d,Vγ4 T淋巴细胞清除组小鼠剩余创面面积百分比明显低于对照组(t＝5.92、5.74、7.17、5.38、5.57,P<0.01)；培养1、2、8 d,2组小鼠剩余创面面积百分比相近(t＝1.46、3.17、3.10,P>0.05)。(3)伤后3 d,与对照组比较,Vγ4 T淋巴细胞清除组小鼠创缘表皮组织的IL－17A蛋白表达明显下降,IGF－Ⅰ蛋白表达明显升高(t＝8.47、19.24,P<0.01)。(4)小鼠表皮细胞角蛋白14阳性细胞率为94.7%。(5)培养5 d后,对照组小鼠表皮细胞角蛋白14阴性细胞率明显高于IGF－Ⅰ组,明显低于IL－17A组(t＝7.25、5.64,P<0.01)。培养10 d后,对照组小鼠表皮细胞角蛋白10阳性细胞率明显高于IGF－Ⅰ组,明显低于IL－17A组(t＝3.99、10.82,P<0.05或P<0.01)。(6)相较于对照0 d组,对照7 d组、IGF－Ⅰ组和IL－17A组小鼠表皮细胞培养7 d后CFSE荧光波峰左移。相较于对照7 d组,IGF－Ⅰ组和IL－17A组小鼠表皮细胞培养7 d后CFSE荧光波峰均左移。(7)培养5 d后,对照组CFSE阳性小鼠表皮细胞角蛋白14阴性细胞率明显高于IGF－Ⅰ组(t＝9.91,P<0.01),对照组CFSE阳性小鼠表皮细胞角蛋白14阴性细胞率明显低于IL－17A组(t＝6.49,P<0.01)。结论 在创面愈合过程中,DETC分泌的IGF－Ⅰ促进小鼠角蛋白14阳性表皮细胞增殖并抑制其终末分化,Vγ4 T淋巴细胞分泌的IL－17A促进其增殖及终末分化,从而影响创面愈合。
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单位第三军医大学; 中国人民解放军陆军军医大学
