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摘要
旨在构建牦牛lncRNA ENSBGRT00000000387.1过表达慢病毒载体，并将其感染牦牛卵泡颗粒细胞（granulosa cells，GCs），了解它对细胞凋亡的影响。本研究提取牦牛卵泡RNA，以RT-PCR技术扩增lncRNA ENSBGRT00000000387.1全长序列，而后构建其重组质粒，并以慢病毒包装系统（pVSVG:pMDL:pRev） 包装后利用qPCR法测定在293T细胞上的感染滴度，再感染分离培养的牦牛GCs，以qPCR检测GCs中lncRNA ENSBGRT00000000387.1的表达水平，并以流式细胞仪检测GCs的凋亡率，以Western blot和qPCR分别检测促凋亡基因CASPASE3和BAX和抑凋亡基因BCL-2的mRNA和蛋白表达水平。结果显示，由牦牛卵泡中成功扩增出lncRNA ENSBGRT00000000387.1的全长2 566 bp序列，将其与LV-EF1a-EGFP-2A载体同源区的片段同源重组，经酶切鉴定及测序验证表明成功构建了重组质粒，将之经慢病毒包装系统包装和浓缩后，在293T细胞的感染效率达（75.77±0.850）%，qPCR测定结果显示该慢病毒滴度为7.32×108 TU·mL-1 ，表明目的lncRNA过表达慢病毒载体成功构建；以该慢病毒感染牦牛卵泡GCs的感染效率达（52.93±1.168）%，qPCR结果显示感染GCs中目的lncRNA表达水平显著升高（P＜0.01）；流式细胞仪检测发现慢病毒感染组细胞凋亡率显著下降（P＜0.01），促凋亡基因CASPASE3和BAX在mRNA和蛋白水平的表达量显著降低（P＜0.01），而抑凋亡基因BCL-2表达量显著升高（P＜0.01）。本试验成功构建了lncRNA ENSBGRT00000000387.1慢病毒载体，成功感染牦牛卵泡GCs后发现具有抑制细胞凋亡的作用，说明其可能在牦牛卵泡功能中发挥作用。
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