无动物源成分纯细胞因子从深低温冻存脐血中高效扩增NK细胞

作者：刁小娟; 石超群; 李栋; 王帅; 肖春; 刘**; 曲廷瑜; 杨卫娟; 贾晓鹏^*

来源：中国组织工程研究, 2023, 27(10): 1572-1577.

• 冷冻脐血
• NK细胞
• 因子
• 扩增
• 细胞毒性
• 凋亡率
• 配型
• 临床应用

背景：从深低温冻存脐血中获得大量高纯度无滋养层细胞、无动物源成分的NK细胞，以便更好地开展NK细胞杀伤肿瘤的实验研究，此次研究通过使用NK扩增培养试剂盒和血清替代物，以获得安全、高效的体外扩增培养NK细胞的方法。目的：建立一种从冷冻脐血中采用纯细胞因子扩增NK细胞的技术体系并证明其体外杀瘤能力。方法：解冻液氮存储的冻存脐血，优化复苏体系，采用Ficoll密度梯度离心的方法收集脐血单个核细胞，接种于预先铺板的T175培养瓶中，采用细胞因子试剂盒+血清替代物法培养21 d后收集细胞并计数，应用流式细胞术检测细胞中CD3-CD56+的比例，并将所得数据与K562滋养层细胞+胎牛血清的培养方法进行对比分析。同时以髓系白血病细胞K562为靶细胞，采用CCK-8试剂盒检测不同效靶比NK细胞杀伤K562细胞的作用。最后进行了12 h内的模拟储存运输实验，采用流式检测CD3-CD56+的比例变化，并使用Annexin V/PI双染法检测细胞凋亡率。结果与结论：(1)采用K562滋养层细胞+胎牛血清的培养方法扩增培养14 d，细胞扩增(51.47±4.28)倍；采用细胞因子试剂盒+血清替代物法扩增培养21 d，细胞数量5×109以上，细胞扩增(328.32±116.36)倍，细胞扩增倍数明显升高，2种方法获得的CD3-CD56+纯度比例均在80%以上，未见明显差异；(2)纯细胞因子方法培养后的NK细胞对K562细胞的杀伤效果(效靶比=10∶1)达80%以上；(3)在12 h的模拟储运实验中，CD3-CD56+的比例变化不明显，直至第12小时，NK细胞凋亡率<7%;(4)结果表明：优化复苏体系和纯细胞因子扩增方法可以高效培养出高纯度的NK细胞，同时具有有效杀伤K562肿瘤细胞的能力，且经过12 h储运后仍然具有良好的细胞纯度和较低的凋亡率。

• 单位
  山东省齐鲁干细胞工程有限公司; 山东大学齐鲁医院