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摘要
目的探讨黄芪甲苷对人内皮祖细胞(EPC)分泌外泌体及外泌体中微小RNA-126(miRNA-126)表达的影响。方法取湖南中医药大学第一附属医院妇产科2019年出生的1名足月健康新生儿脐带血, 采用密度梯度离心法分离单个核细胞并培养7 d, 其间行形态学观察;取第3代细胞, 采用CD31免疫磁珠分选法和双荧光染色法鉴定。将鉴定成功的EPC按照随机数字表法分为黄芪甲苷组和磷酸盐缓冲液(PBS)组。黄芪甲苷组细胞加入终质量浓度100 mg/L的黄芪甲苷培养24 h, PBS组细胞加入等体积的PBS培养24 h。培养结束后收集2组细胞培养上清液中的外泌体, 采用蛋白质印迹法检测外泌体特征性标志物CD9、CD63和CD81表达, 于透射电子显微镜下观察EPC外泌体(EPC-Exo)形态, 采用纳米颗粒跟踪分析技术检测EPC-Exo的粒径, 采用二辛丁酸法测定EPC-Exo的浓度(样本数为3), 采用反转录PCR法测定EPC-Exo中与血管新生相关miRNA-126-3p和miRNA-126-5p的表达(样本数为3)。对数据行独立样本t检验。结果 (1)培养第4天, 细胞开始贴壁生长, 圆形、梭形、条形等多形态同时出现;继续培养至第7天时, 细胞边缘清晰, 呈铺路石样排列, 中央细胞呈圆形, 周边细胞呈梭形。(2)CD31免疫磁珠分选法显示细胞膜染绿色, 细胞核染蓝色;双荧光染色法显示细胞呈橙黄色。经以上鉴定, 细胞被证实为EPC。(3)培养24 h, 2组EPC-Exo的CD9、CD63和CD81表达均呈阳性, 证实本实验已成功提取EPC-Exo。(4)培养24 h, 2组EPC-Exo均呈圆形膜囊泡, 形态无明显差异。(5)培养24 h, 黄芪甲苷组中98.7%的EPC-Exo粒径为84.7～143.1 nm, PBS组中98.0%的EPC-Exo粒径为88.7～123.5 nm。(6)培养24 h, 黄芪甲苷组EPC-Exo的质量浓度为(310±5)μg/mL, 明显高于PBS组的(257±5)μg/mL, t=13.369, P<0.01。(7)培养24 h, 黄芪甲苷组EPC-Exo中miRNA-126-3p(t=16.062, P<0.01)和miRNA-126-5p(t=3.252, P<0.05)均明显多于PBS组。结论黄芪甲苷可改善人EPC分泌外泌体的功能, 且所分泌的外泌体负载miRNA-126。
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