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摘要
目的：验证益肾通络方(YSTLF)对肾小管上皮细胞凋亡的影响，并基于内质网应激通路蛋白激酶R样内质网激酶(PERK)/活化转录因子4(ATF4)/转录因子C/EBP同源蛋白(CHOP)探讨其作用机制。方法：将db/db小鼠随机分为db/db组、db/db+缬沙坦(Valsartan)组(10 mg·kg-1·d-1)、db/db+YSTLF低、中、高组(1、2.5、5 g·kg-1·d-1)给与药物干预8周后取材。同窝的db/m小鼠作为正常组。体外培养人肾小管上皮细胞(HK-2)，分为正常组、糖基化终产物(AGEs)组、AGEs+益肾通络方低、中、高组(100、200、400 μg·mL-1)；原位末端转移酶标记技术(TUNEL)染色检测HK-2细胞的凋亡情况；细胞活力测定实验检测HK-2细胞存活率；钙离子荧光探针染色，以及荧光素酶报告基因法检测为折叠蛋白反应元件(UPRE)荧光素酶活力，检测内质网应激情况；免疫组化法(IHC)检测小鼠肾脏中磷酸化 (p) -PERK蛋白的表达(p-PERK)、CHOP、ATF4的蛋白表达水平；实时荧光定量PCR法(RT-PCR)检测小鼠肾脏、HK-2细胞中CHOP、X盒结合蛋白1(XBP1)的mRNA表达水平；蛋白质印迹法(Western blot)检测小鼠肾脏、HK-2细胞中p-PERK、PERK、CHOP、ATF4、B淋巴细胞瘤2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、切割型半胱天冬酶-3(cleaved caspase-3)的蛋白表达水平。结果：细胞实验中，与正常组相比，AGEs组HK-2细胞活力显著降低，凋亡率升高(P<0.01)。凋亡相关因子Bcl-2的mRNA和蛋白表达水平显著降低(P<0.01)，Bax的mRNA和蛋白表达水平显著升高(P<0.01)，cleaved Caspase-3的蛋白表达水平显著升高(P<0.01)。与AGEs组相比，YSTLF给药处理后，细胞活力提升，凋亡率降低(P<0.01)。Bcl-2的mRNA和蛋白表达水平呈时间、剂量依赖性显著升高(P<0.01)，Bax的mRNA和蛋白表达水平呈时间、剂量依赖性显著降低，cleaved Caspase-3的蛋白表达水平呈时间、剂量依赖性显著降低(P<0.01)。与正常组相比，AGEs组细胞内Ca2+失衡，UPRE荧光素酶荧光强度增加(P<0.01)。内质网应激相关因子CHOP、XBP1的mRNA水平显著升高(P<0.01)，p-PERK、CHOP、ATF4的蛋白表达水平显著提高(P<0.05)。与AGEs组相比，YSTLF可有效改善HK-2细胞内Ca2+失衡，剂量依赖性降低UPRE荧光强度(P<0.01)。降低内质网应激相关因子CHOP、XBP1的mRNA水平(P<0.01)，剂量、时间依赖性降低细胞内p-PERK、CHOP、ATF4的蛋白表达水平(P<0.01)。动物实验中，与db/m小鼠相比，db/db组小鼠Bcl-2的蛋白表达水平显著降低，cleaved Caspase-3、Bax的蛋白表达水平显著升高(P<0.05)。与db/db小鼠组相比，YSTLF给药组Bcl-2的蛋白表达水平呈剂量依赖性提升，cleaved Caspase-3、Bax的蛋白表达水平呈剂量依赖性降低(P<0.01)。与db/m小鼠相比，db/db组小鼠内质网应激相关因子CHOP、XBP1的mRNA表达水平明显升高(P<0.01，P<0.05)，p-PERK、CHOP、ATF4的蛋白表达水平显著提高(P<0.05)。与db/db小鼠组相比，YSTLF可显著降低CHOP、XBP1的mRNA表达水平(P<0.01)，降低p-PERK、CHOP、ATF4的蛋白表达水平(P<0.01)；结论：YSTLF可有效抑制内质网应激、改善肾小管上皮细胞凋亡情况，其作用机制可能与调节PERK/AFT4/CHOP通路有关。
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