小鼠Krüppel样因子4 RNA干扰慢病毒载体的构建及鉴定

作者：李鑫; 周茂彬; 李琦; 孙亮; 李祎; 马永强; 周欣; 姬文婕; 魏路清

来源：武警后勤学院学报(医学版), 2017, 26(01): 1-6.

DOI：10.16548/j.2095-3720.2017.01.001

• Krüppel样因子4
• RNA干扰
• 慢病毒

【目的】构建小鼠Krüppel样因子4 RNA干扰慢病毒表达载体,并观察KLF4基因在小鼠腹腔巨噬细胞RAW264.7细胞中的表达情况。【方法】根据Gen Bank中基因信息,采用干扰序列设计软件设计靶点,合成、制备KLF4-sh RNA DNA片段,与载体连接构建真核表达慢病毒干扰载体p LVX-KLF4-sh RNA,转化感受态,筛选阳性克隆,并进行测序鉴定。在Lipofectamine~?3000的介导下,p LVX-KLF4-sh RNA1/2与ps PAX2、p MD2.G辅助质粒共转染293T细胞,包装产生病毒Lenti-KLF4 1/2,将重组的慢病毒感染RAW264.7细胞,实时定量PCR法检测KLF4 m RNA的表达。收集病毒上清并浓缩测定病毒滴度。【结果】经测序证实,沉默小鼠KLF4基因的真核表达慢病毒干扰载体构建成功,倒置荧光显微镜下可见包装细胞293T细胞表达绿色荧光,RT-PCR证实RAW264.7细胞中KLF4 m RNA的敲除效率分别在60%、75%左右(P<0.05)。初次浓缩后测定小鼠KLF4基因重组慢病毒的滴度为1.65×108TU/ml。【结论】成功构建出KLF4的RNA干扰慢病毒载体p LVX-KLF4-sh RNA 2可用,并包装出慢病毒,为本实验在后续的体内体外研究中探讨KLF4的作用机制奠定了实验基础。

• 单位
  武警后勤学院