犬流感病毒NP基因在昆虫细胞中的表达及其抗体间接ELISA检测方法的建立

作者：楼晶瑶; 王晓丽; 欧阳伟; 夏兴霞; 诸玉梅; 潘群兴; 王晶宇; 安欣; 姚凌云; 王永山; 刘永杰

来源：中国兽医科学, 2017, 47(06): 680-686.

DOI：10.16656/j.issn.1673-4696.2017.06.002

• 犬流感病毒
• NP蛋白
• 杆状病毒表达系统
• 间接ELISA

旨在利用昆虫细胞表达犬流感病毒(CIV)核蛋白(NP),并以此作为抗原建立检测CIV抗体的间接ELISA方法。从CIV感染的MDCK细胞中提取总RNA,用RT-PCR法扩增NP基因,连接到pFastBacHTA载体上,转化含Bacmid的DH10Bac感受态细胞,获得穿梭质粒NP-DH10,穿梭质粒转染sf-9昆虫细胞,获得重组病毒P1-NP。病毒传至第3代后,用Western-blot及IFA鉴定昆虫细胞表达的蛋白与兔抗犬流感病毒NP蛋白多克隆抗体及鼠抗CIV血清发生特异性反应。NP蛋白纯化后作为抗原,建立检测CIV抗体的间接ELISA方法。优化后确定蛋白最佳包被浓度为2 g/mL,血清最佳稀释度为1∶100。用建立的间接ELISA方法和血凝抑制(HI)同时检测136份血清样品,ELISA法检出129份阳性,检出率为94.85%;HI检出120份阳性,检出率为88.23%,二者符合率为93.38%,ELISA检测方法的阳性率高于血凝抑制。结果表明,利用昆虫细胞表达的NP蛋白做为抗原,建立的检测CIV抗体的间接ELISA方法特异性好,重复性高,可用于犬流感的诊断和流行病学调查。

• 单位
  江苏省农业科学院; 农业部