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摘要
目的:建立针对真菌类中药材茯苓的聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)鉴定技术，从分子生物学角度出发，对茯苓的真伪进行鉴定。方法:对经典十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法进行改良，提取样品基因组DNA,以茯苓内转录间隔区(internal transcribed space, ITS)为目的序列，设计特异性引物，优化PCR反应体系，建立茯苓PCR鉴定方法，同时克隆特异性扩增的目的条带，测序鉴定其准确性，最后进行方法学验证。结果:提取的基因组DNA浓度较高、纯度较好、完整度良好。琼脂糖凝胶电泳结果表明正品茯苓可以在199 bp处出现单一明亮的特异性扩增条带，而伪品不出现扩增条带，引物的特异性为100%,克隆后的目的片段电泳图谱清晰明亮，克隆片段与Genbank数据库中已登记的茯苓物种序列相似性高达100%。在操作人员不知样品真伪的情况对样本检测，目标条带出现位置与预期一致；灵敏度检测结果表明，DNA检测下限可达1 ng·μL-1;挑选3位实验室人员进行茯苓真伪检测，结果相同且和预期一致，建立的茯苓PCR鉴定方法特异性良好，准确性高，重复性好。结论:PCR鉴定技术为茯苓的真伪鉴别提供了简便可靠、特异性良好，并且准确性高的鉴别方法。采用分子克隆技术可以成功保存茯苓标准对照品，测序结果准确可靠。
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