圆红冬孢酵母自主复制序列分离和利用游离质粒进行基因敲除

作者：郭霄; 史硕博^*

来源：微生物学报, 2023, 1-15.

DOI：10.13343/j.cnki.wsxb.20230576

• 圆红冬孢酵母
• 自主复制序列
• 游离质粒

【目的】与整合型载体相比，游离型表达载体通常具有更高的拷贝数以实现强基因表达，并且对于DNA操作应用更加方便和灵活。然而，目前的研究尚未确定适用于圆红冬孢酵母的游离型质粒，该酵母外源基因的表达或者基于CRISPR/Cas9的基因组编辑都需要通过整合方式来完成，这也是对其遗传改造进展缓慢的一个重要原因。本研究目的是构建圆红冬孢酵母的游离质粒，使得其外源基因的表达和基因组编辑更方便省时。【方法】本文首先对圆红冬孢酵母苯丙氨酸氨裂解酶基因（PAL）中可能存在的ARS序列进行了挖掘和表征，将该基因及其上下游序列进行分段扩增，构建到带有β-异丙基苹果酸脱氢酶基因（LEU2）的质粒中，通过电转化的方法导入LEU2基因缺陷的圆红冬孢酵母中，根据转化效率高低鉴定了该酵母的一个自主复制序列（ARS）。其次，以香叶基香叶基焦磷酸合成酶基因（BTS1）为敲除靶点，将其gRNA构建到基于ARS序列的游离质粒中，通过转化子直观的颜色变化来验证该游离质粒是否成功应用于圆红冬孢酵母的CRISPR/Cas9体系。【结果】本工作鉴定了圆红冬孢酵母的ARS序列，构建了基于ARS元件的游离质粒，并将该质粒应用于圆红冬孢酵母CRISPR/Cas9体系，成功实现了基于游离质粒的基因敲除。【结论】该工作丰富了圆红冬孢酵母现有的工具库，为圆红冬孢酵母的合成生物学应用提供了良好的研究基础和技术支持。

• 单位
  北京化工大学