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摘要
目的 建立H2O2诱导HEI-OC1细胞凋亡模型，以噪声性聋小鼠耳蜗内氧化应激水平为依据，模拟病理状态毛细胞(hair cell)氧化应激损伤，为大规模抗氧化药物筛选建立体外氧化应激介导细胞损伤实验模型。方法 体外培养HEI-OC1细胞系，采用不同浓度H2O2处理不同时间构建氧化应激损伤细胞模型，进行细胞活性检测，并统计分析半抑制浓度(IC50)；同时结合120dB白噪声处理4h后致聋小鼠耳蜗内氧化应激水平，共同确定体外细胞模型最适诱导条件。免疫荧光检测1 mM H2O2诱导12h下线粒体ROS及细胞凋亡过程中关键性半胱氨酸死亡蛋白酶Caspase 3激活情况；用Western blot检测各组细胞中Caspase 3、4-HNE、线粒体途径促凋亡蛋白信号分子Bax及凋亡抑制因子Bcl-2的表达情况。结果 不同浓度H2O2作用12h条件下，HEI-OC1细胞系随着H2O2浓度的升高细胞活力明显下降，半抑制浓度(IC50)约在0.736mM；因此后续分别选取0.5mM和1 mM H2O2处理不同时间，观察发现HEI-OC1细胞系随着双氧水处理时间的延长细胞活力明显下降；此外，免疫荧光结果表明，H2O2诱导HEI-OC1产生mtROS积累、Caspase-3激活，同时WB数据证明，双氧水处理后的HEI-OC1细胞内存在4-HNE累积(且升高水平与噪声处理后小鼠耳蜗组织内4-HNE水平相当)、及Caspase 3激活、Bax升高，Bcl-2表达下降现象，预示H2O2可介导HEI-OC1氧化应激反应，并进一步诱导细胞凋亡。结论 H2O2诱导HEI-OC1凋亡过程中，细胞活性减弱与H2O2剂量和处理时间密切相关，且1mM H2O2刺激细胞后诱发与噪声致聋小鼠耳蜗内近似程度的氧化应激反应及细胞凋亡现象。综上，该模型较为理想的模拟了耳蜗氧化应激损伤病理状态，有望为后续in vitro实验模拟氧化损伤及保护性药物筛选工作奠定必要理论基础。
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单位嘉兴学院附属第二医院; 徐州医科大学
