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摘要
目的研究甲基转移酶样蛋白14(METTL14)在卵巢上皮性癌(卵巢癌)组织中的表达及其临床意义, 探讨上调和下调METTL14表达对卵巢癌细胞系A2780、SKOV3细胞增殖、侵袭和迁移的影响。方法 (1)组织标本检测:选取2019年12月—2020年11月在广西医科大学附属肿瘤医院行手术治疗的20例卵巢癌患者的新鲜癌组织标本, 收集同期因子宫肌瘤行子宫及双侧附件切除术的15例患者的新鲜正常卵巢组织标本作为对照, 免疫组化法检测卵巢癌与正常卵巢组织中METTL14蛋白表达的差异。另收集2014年1月—2019年10月在广西医科大学附属肿瘤医院行手术治疗的121例卵巢癌患者的癌组织蜡块, 免疫组化法检测卵巢癌组织中METTL14蛋白的表达, 并分析METTL14蛋白表达与卵巢癌患者临床病理特征及预后的关系。(2)细胞实验:分别使用慢病毒载体、小分子干扰RNA(siRNA)技术, 构建上调、下调METTL14表达的卵巢癌A2780、SKOV3细胞系, 并采用逆转录(RT)-实时荧光定量PCR(qPCR)技术和蛋白印迹(western blot)法分别验证其METTL14 mRNA和蛋白的表达。后续的细胞实验分为5组, LV-METTL14组(转染慢病毒载体上调METTL14表达)及其对照LV-NC组(转染阴性对照慢病毒空载体), si-METTL14组(转染si-METTL14-2下调METTL14表达)及其对照si-NC组(转染阴性对照siRNA), 以及空白组(未转染)。采用液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)法检测各组卵巢癌细胞中N-6甲基腺嘌呤(m6A)修饰水平的变化, 分别采用活细胞计数(CCK-8)法、划痕实验以及穿膜(transwell)小室侵袭和迁移实验检测各组卵巢癌细胞增殖、愈合以及侵袭和迁移能力的变化。结果 (1)20份卵巢癌组织中METTL14蛋白的免疫组化总评分为(6.2±3.7)分, 显著高于15份正常卵巢组织[(3.3±2.5)分;t=-2.64, P=0.012]。121例卵巢癌患者中, METTL14蛋白高表达(免疫组化总评分≥6分)69例(57.0%, 69/121), METTL14蛋白低表达(免疫组化总评分<6分)52例(43.0%, 52/121);METTL14蛋白高表达与METTL14蛋白低表达患者比较, 手术病理分期更晚, 淋巴结转移率、腹腔转移率、腹水发生率更高, 分别比较, 差异均有统计学意义(P均<0.05);METTL14蛋白高表达患者的总生存率显著低于METTL14蛋白低表达者(P=0.009)。(2)LC-MS/MS法分析显示, LV-METTL14组A2780和SKOV3细胞中m6A的表达水平分别为0.213±0.024、0.181±0.018, 均显著高于LV-NC组(分别为0.109±0.022、0.128±0.020;P均<0.05);而si-METTL14组A2780和SKOV3细胞中m6A的表达水平分别为0.063±0.012、0.069±0.015, 均显著低于si-NC组(分别为0.108±0.014、0.121±0.014;P均<0.05)。CCK-8法检测显示, si-METTL14组SKOV3细胞在培养在36、48、60 h时的吸光度(A)值均显著低于si-NC组(P均<0.05);LV-METTL14组A2780和SKOV3细胞在培养48、60 h时的A值均显著高于LV-NC组(P均<0.01)。划痕实验显示, 培养24 h, si-METTL14组A2780和SKOV3细胞的迁移率低于si-NC组, LV-METTL14组A2780和SKOV3细胞的迁移率高于LV-NC组, 分别比较, 差异均有统计学意义(P均<0.01)。在transwell小室侵袭、迁移实验中, 培养24 h, si-METTL14组A2780和SKOV3细胞的穿膜细胞数均少于si-NC组, LV-METTL14组A2780和SKOV3细胞的穿膜细胞数均多于LV-NC组, 分别比较, 差异均有统计学意义(P均<0.01)。结论 METTL14蛋白高表达的卵巢癌患者的预后更差。上调METTL14表达可提高卵巢癌细胞m6A修饰水平, 促进卵巢癌细胞的增殖、侵袭和迁移;反之, 下调METTL14表达则降低卵巢癌细胞m6A修饰水平, 抑制卵巢癌细胞的增殖、侵袭和迁移。
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单位广西医科大学附属肿瘤医院
