科研之友
微信
新浪微博
Facebook
分享链接
摘要
目的探讨脂多糖(LPS)刺激下NUFIP-1介导核糖体自噬在树突细胞(DCs)凋亡中的作用及意义。方法将培养的树突细胞系DC2.4分为空白对照组及LPS刺激6、12、24、48、72 h组(n=5), LPS各亚组加入1 μg/mL LPS培养相应时间。采用Western blot检测各组细胞NUFIP-1及自噬相关蛋白p62和LC3B表达水平, 激光共聚焦显微镜检测NUFIP-1在细胞中的表达与定位及其分别与Lyso-tracker、LC3B共定位情况。将载有沉默空载体NS及沉默慢病毒载体NUFIP-1 siRNA感染DC2.4 (n=3), 以1 μg/mL LPS刺激24 h, 应用流式细胞分析术检测细胞凋亡情况, 并采用Western blot检测凋亡相关蛋白包括胱天蛋白酶(cleaved-caspase-3)和Bcl-2表达水平。多组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA), 采用LSD-t法进一步进行组间两两比较。以P<0.05为差异有统计学意义。结果 Western blot结果提示, LPS刺激不同时间(6、12、24、48、72 h)后DC2.4中NUFIP-1蛋白表达水平呈现先升高后下降趋势, 其中LPS 24 h组NUFIP-1表达水平显著高于空白对照组[空白对照组:(0.6786 ± 0.0820);LPS 24 h组:(1.4830 ± 0.1170), P<0.01]。同时, LPS 24 h组p62表达水平显著低于空白对照组[空白对照组:(0.9087 ± 0.1235);LPS 24 h组:(0.3113 ± 0.5571), P<0.01]。LPS 24 h组LC3B-I向LC3B-Ⅱ的转化显著高于空白对照组[空白对照组:(0.5542 ± 0.1248);LPS 24 h组:(2.5310 ± 0.3119), P<0.01]。激光共聚焦显微镜观察显示, NUFIP-1主要定位于细胞核及核周, LPS刺激后其荧光强度于6 h至24 h呈时间依赖性增强, 而刺激48、72 h明显减弱。同时, NUFIP-1与Lyso-tracker及LC3B的共定位较空白对照组显著增强。采用慢病毒感染技术感染NUFIP-1 siRNA可显著下调DC2.4 NUFIP-1表达水平, 与空白对照组及空载体组比较分析, 差异有统计学意义[空白对照组:(0.6627 ± 0.1707);空载体组:(0.6966 ± 0.1107);siRNA组:(0.1428 ± 0.0296), P<0.05]。流式细胞分析术显示, NUFIP-1 siRNA感染组在LPS刺激后较空白对照LPS 24 h组及空载体LPS 24 h组DC2.4凋亡率显著升高[空白对照LPS 24 h组:(47.91%±1.006%);空载体LPS 24 h组:(70.26% ± 1.011%);siRNA LPS 24 h组:(80.23% ± 2.094%), P<0.01]。Western blot分析进一步证实, NUFIP-1 siRNA感染组相较空白对照组及空载体组在LPS刺激下DC2.4凋亡相关蛋白cleaved-caspase-3表达显著增强[空白对照LPS 24 h组:(0.4748 ± 0.0876);空载体LPS 24 h组:(0.2849 ± 0.0418);siRNA LPS 24 h组:(0.9733 ± 0.0525), P<0.01], 抗凋亡蛋白Bcl-2表达则明显下调[空白对照LPS 24 h组:(0.7810 ± 0.0490);空载体LPS 24 h组:(0.8292 ± 0.0729);siRNA LPS 24 h组:(0.3957 ± 0.0838), P<0.05]。结论 LPS刺激后DC2.4中NUFIP-1介导核糖体自噬明显活化, 且对DC2.4凋亡具有显著保护效应。
-
单位温州医科大学附属第一医院; 解放军总医院
