靶向TPX2基因shRNA慢病毒载体的构建及鉴定

作者：常海平; 宋淑芳; 任杰

来源：基础医学与临床, 2017, 37(07): 945-952.

DOI：10.16352/j.issn.1001-6325.2017.07.008

• 宫颈癌
• TPX2-shRNA
• 慢病毒

目的构建靶向TPX2基因的RNA干扰慢病毒载体,获得稳定感染的人宫颈癌He La细胞株,为宫颈癌细胞TPX2基因的相关研究奠定基础。方法以TPX2基因为靶点,设计并合成四组对应于目标shRNA的双链DNA发卡结构,分别与慢病毒载体Pglv2-U6-Puro连接经转化感受态细胞,阳性克隆经测序、病毒包装、滴度测定、感染细胞、嘌呤霉素筛选得到TPX2基因沉默稳转细胞株。实时荧光定量PCR和Western blot检测TPX2 mRNA和蛋白的沉默效果。流式细胞计量术检测其对细胞周期分布及凋亡的影响。结果测序结果证实5种慢病毒载体均包装成功,采用0.4μg/m L嘌呤霉素成功筛选出TPX2沉默细胞株。He La细胞感染4种载有TPX2-shRNA的重组慢病毒后,均发挥了沉默效应,尤以TPX2-shRNA-1沉默效果最佳,TPX2 mRNA相对表达量为0.21±0.07,低于对照组的1.08±0.07(P<0.01);TPX2蛋白质相对表达量为0.19±0.28,低于对照组的0.64±0.03(P<0.01);G2及S期细胞高于对照组(P<0.05);细胞凋亡率明显多于对照组(P<0.05)。结论获得了一种有效TPX2基因的干扰序列,成功构建了TPX2 shRNA慢病毒干扰载体,并筛选出TPX2基因沉默的He La细胞株,为进一步研究TPX2基因在宫颈癌中的作用奠定了基础。

• 单位
  内蒙古医科大学附属医院